时间分辨荧光免疫定量分析简介

时间分辨荧光免疫分析（Timeresolved Fluoroimmunoassay,TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。

解离增强镧系元素荧光免疫分析

解离增强镧系元素荧光免疫分析（Dissociation Enhanced Lanthanide FluoroimmunoassayDELFIA）是时间分辨荧光免疫分析中的一种。它用具有双功能基团结构的螯合剂，使其一端与铕（Eu）连接，另一端与抗体/抗原分子上的自由氨基连接，形成EU标记的抗体/抗原，经过免疫反应之后生成免疫复合物。由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱，因此加入一种增强剂，使Eu3+从复合物上解离下来，自由Eu3+同增强剂中的另一种螯合剂螯合形成一种胶态分子团，这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光，信号增强了百万倍。因为这种分析方法使用了解离增强步骤，因此称为解离增强镧系元素荧光免疫分析。

两对半定量测定

乙肝病毒（HBV）标记物的检测方法常用测定乙肝病毒的抗原、抗体标记物，由60年代末70年代初的琼脂扩撒法，依次发展为血凝法→酶联免疫吸附（ELISA）、同位素免疫标记（RIA）→化学发光免疫分析、生物发光、电化学发光免疫标记和80年代中建立的稀土离子荧光标记（时间分辨荧光免疫分析 ）等不同的检测方法。随着科学的发展和检验技术的进步，其方法每发展一步，乙肝标记物检出的灵敏度和准确性都得到不同的提高（其中RIA为10-12mol/L、ELISA为10-9mol/L、CLIA为10-15mol/L、ECL10为-17/L、TRF为10-18mol/L）。其中时间分辨荧光免疫分析（TRF）为近年新研制成功的用三价稀土离子作为示踪物，以单克隆抗体包被支持物与样品中抗原反应，再加入用铕（EU）标记的抗体，进行反应检测，可大大降低一般同位素和荧光标记受环境干扰缺点，提高了检测的灵敏度和准性，该TRF法检测乙肝病毒标记物较其他方法灵敏度高、特异性好，因干扰因素少可大地优于以上各种方法，可与HBV-DNA的检测相比(未经规范化要求开展的HBV-DNA检测，多年的临床实验证明，假阳性、假阴性率较高，重复性差，且不能定量。TRF为目前检测乙肝病毒标记物最理想的方法。TRF定量检测乙肝病毒“两对半”为临床诊断乙肝提供了新手段，有助于临床客观的分析HBV感染情况、疗效的观察和转归等情况的分析，至少可对下列情况更具有独特的诊断价值：

（1）治疗前进行病毒定量检测，可以指导选择抗病毒药物，避免盲目用药。

（2）治疗后定量间接判断体内病毒数量，有助于疗效的观察。

（3）怀孕前进行定量测定，有助于选择有利的怀孕时机。乙肝孕妇进行定量检查，有助于使部分病人得到及时的正确的诊断。

时间分辨荧光免疫定量测定乙肝两对半的临床意义

目前我科已正式开展了乙肝二对半的TRFIA定量分析，其每一项的正常值范围均是由我国卫生部根据美国雅培的标准而制定，其灵敏度，准确度，及精确度都有远远优于一般的ELISA法，乙肝两对半的定量制定将给临床提供一个关于乙肝诊断及疗效，预后判断的更可靠的实验结果。

1、极大地提高了检测的灵敏度

时间分辨荧光免疫定量技术（TRFIA）检测HbsAg灵敏度可达0.2ng/ml，而酶标（EIASA）检测的灵敏度是2ng/ml，极大地提高检测的灵敏度。因此，在急性乙肝早期能及早检出HbsAg，确证HBV感染，缩短窗口期；其次，可发现低浓度HbsAg携带者；在部分慢性乙肝患者中，由于机体缺乏对HBV包膜蛋白的免疫应答，HbsAg表达较低，酶标检测可出现HbsAg和 HbsAb均阴性的情况，TRF技术则可避免这些情况的发生，为正确判断病情提供依据。

2、能动态观察疗效和监测病情

（1）定量分析HBsAg和 HBsAb的浓度变化，可预见急性乙肝是否处于恢复期。如HBsAg浓度降低，HBsAb浓度逐渐升高，可说明病情正往恢复期发展；反之，HBsAg浓度处于较高水平或上升趋势，而HBsAb一直处于较低水平，则易发展为慢性乙肝或病毒携带者。

（2）定量分析HBeAg和HBeAb的浓度变化，可反映病情变化和治疗效果。定量测定能明确检测HBeAg向HBeAb转换的时期，即表现为HBeAg浓度下降和HbeAb升高的过程。高浓度的HBeAg还可间接提示病毒处于高复制状态，具有较高的传染性。高浓度的HBeAb一方面提示病情好转，而在某些时候（如肝功能指标很差）则可能与肝坏死、肝硬化、肝癌有关。

（3）HBcAb浓度的高低可反映病毒感染的状态。高浓度的抗-Hbc提示乙肝急性感染，恢复期浓度降低。慢性乙肝呈抗-Hbc持续高浓度。而低浓度的抗-Hbc一般为恢复期或既往感染。

（4）有利于对慢性肝炎活动性或非活动性的判断。非活动性慢性乙肝各项指标相对稳定，活动性往往呈现进行性变化。

3、TRFIA和定量PCR技术可互相补充

血清HBV—DNA荧光定量PCR测定可以直接反映血液中病毒复制状态，具有很多临床应用价值，但不能完全反映病毒复制静息期肝细胞内HBV病毒状态。HBV—DNA阴性并不完全代表体内HBV已被清除，结合“两对半”各项指标更能客观反映体内HBV病毒状态。

4、HbsAb的定量测定能够对乙肝的预防起到监督作用

HbsAb的定量测定能够对抗体是否真正具有“中和”HBV的免疫力作出正确评价，对乙肝的预防起到监督作用。HbsAb的含量在10mlU/ml以上病人ELISA检测即可呈阳性结果，但并不提示机体都一定具有免疫力，而HBsAb 的含量在10—100mlU/ml之间的样本，定性虽为“阳性”，但此时机体对HBV的免疫力较弱，甚至不能预防HBV感染。只有HbsAb的含量达到100mlU/ml以上时才可确定具有抵抗HBV入侵的作用。作定量检测，可根据HBsAb 的含量判断机体对HBV的免疫状态及乙肝疫苗的免疫效果。因此定量测定对乙肝疫苗免疫力的评价和高危人群预防免疫具有重要意义，特别是在少年儿童预防乙肝方面。