小鼠肝脏DNA提取与鉴定

实验原理

DNA 以核蛋白形式存在于细胞核中。蛋白酶K 或链霉蛋白酶 E 均为广谱蛋白酶，其重要特性是能在 SDS 和 EDTA 存在下保持很高的活性。在匀浆后提取 DNA 的反应体系中， SDS 可破坏细咆膜、核膜，并使组织蛋白与 DNA 分子分离， EDTA 抑制细胞中 DNase 活性，蛋白酶 K 或链霉蛋白酶 E 将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使 DNA 分子完整地分离出来。再用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去 DNA 溶液中微量酚的污染。最后用无水乙醇沉淀 DNA 。为获得高纯度 DNA ，操作过程中常加入 RNase 除去 RNA 。获得高分子量 DNA 的关键是防止 DNase 降解 DNA 。故标本必须新鲜，在提取前细胞就保持完整，核、溶酶体等细胞器应没有明显破坏，提取 DNA 用的离心管等器皿及试剂应消毒。操作在4 ℃以下进行。

试剂及器材

1 ．试剂

① 蛋白酶 K ：称取 20mg 蛋白酶 K 溶于 1ml 消毒双蒸水中，－20 ℃备用。

② RNase( 牛胰 ) ：称取 10mg RNase 溶于 lml 下列混合液中： 10mmol/l Tris-HCl ， pH8.0 ； 1mmol/L EDTANa2 pH8.0 ； 50 %甘油。

③ 10 %SDS 溶液：称取 10g SDS 溶于 100ml 消毒双蒸水中，于 65 ℃保温 2 小时，贮存室温备用。

④ 1 × TE 缓冲液 (pH8.0) ： 10mmol/L Tris-HCl pH8.0 ； 1mmol/L EDTANa2 pH8.0 。配制后高压灭菌， 4 ℃贮存。

⑤ 1 × TE 饱和重蒸酚 (pH8.0)

⑥ 氯仿/异戊醇 (24:1V/V) 10mol/LNH4AC ，配制后高压灭菌， 4 ℃贮存

⑦ 无水乙醇 (AR)

⑧ 70 %乙醇

2 ．器材

玻璃匀浆器；离心机；电泳仪；电泳槽；紫外透射反射分析仪。

实验操作

1 ．组织 DNA 的提取

① 取小鼠新鲜肝组织，去除结缔组织，用剪刀剪成细小碎块

② 加 10 倍体积 TE 缓冲液，用玻璃匀浆器在冰浴中中速匀浆，并将匀浆液转入 10ml 离心管以 4000rpm 离心 10 分钟，弃上清

③ 加 10 倍体积 TE 洗一遍，以 4000rpm 离心 10 分钟，弃上清，加适量 TE 稀释

④ 取 400µl 稀释液于 1.5ml 的 Eppendorf 管，缓慢加入 10 %SDS 溶液，至终浓度 0.5 % ( 加 20µl) ，摇匀直至溶液变粘稠

⑤ 加入 Rnase(200µg/ml) 至终浓度 20ug/ml(42µl) 混匀，置 37 ℃保温 60 分钟总体积 (420µl) 。

⑥ 加蛋白酶 K(20mg/ml) 至终浓度 100ug/ml混匀 ( 加 21ul) ，于 50 ℃保温 3 小时，并间歇搅动 ( 总体积 441µl) 。

⑦ 将此溶液冷却至室温，加等体积饱和酚抽提，以 10000rpm 离心 10 分钟；取上清加 1/2 体积饱和酚， 1/2 体积氯仿/异戊醇抽提一次，以 10000rpm 离心 10 分钟；取上清，加等体积氯仿/异戊醇抽提一次，以 10000rpm 离心 10 分钟

⑧ 加 1/10 体积 5MKAc ，加 2 倍体积无水乙醇充分混匀，以 12000rpm 离心 10 分钟

⑨ 加 1ml70 %乙醇洗沉淀，以 12000rpm 离心 10 分钟， 待酒精挥发尽后加 20ul TE 溶解， 4 ℃储存

2 ．电泳鉴定

取 DNA 样品 2µl 加上样缓冲液 10µl ( 含溴酚蓝指示剂和甘油 ) ，在 0.8 %琼脂糖凝胶进行水平微型电泳，电压 <5V/cm ，时间 2 小时左右。电泳后取出凝胶，用 0.5µg/ml 的溴化乙锭染色 20 分钟，用紫外灯观察分析