小鼠肝脏基因组DNA的提取
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实验目的
从新鲜的小鼠肝脏中提取基因组DNA,为southern杂交或DNA文库 的构建做好准备。
我们重点是要保证DNA的序列、产率和纯度,去除Dnase、机械剪切
(对于如此之大的基因组 ,防止机械剪切是很重要的)、物理、化学因素的影响。
实验原理及过程
实验步骤
实验原理
1
将饥饿一天的小鼠用脊髓脱臼法处死。
饥饿一天是为了减少肝中的糖原,以免在提取DNA时糖的去除有太多困难。(试剂CTBA可以去除糖原)
2
0.2g鼠肝,冰冷生理盐水洗3次,剪碎
当组织离开机体,DNA酶就会表现出活性。在冰冷的生理盐水中,可以降低DNA酶的活性,防止基因组 DNA被降解。
因为DNA并没有提出来,所以在这时重要的是防止DNA酶对基因组 DNA的影响。
3
碎鼠肝转入玻璃匀浆器中,加入2mL匀浆液,匀浆6次(冰上操作)。
只能匀浆6次。因为这一步只是将细胞分开,不是破碎细胞。若在此时破碎细胞,细胞中的DNA酶会降解基因组 DNA。
低渗缓冲液破细胞,高渗缓冲液破组织。
冰上操做也是为了降低DNA酶的活性。
4
匀浆液转入2mL小指管,40C , 5000rpm离心2min。
5
沉淀加0.4mL无菌水,吹散,再加0.4mL酶解液,慢慢颠倒混匀
破碎细胞。酶解液中含有蛋白酶K和SDS,这两种试剂不仅以温和方法的破碎细胞而不产生机械剪切以致破坏DNA的完整性,又可以变性Dnase,还可以去除部分的蛋白。另外,还可以使核蛋白体从DNA上解离。(从以后的步骤开始,因为DNA酶已经被变性,而DNA也已尽被提出细胞,所以就要防止机械剪切对DNA的影响。)
6
550C 水浴酶解过夜,40C存放。
7
加RNase ,终浓度200ug/mL,370C保温60min。
RNase可以去除RNA,在这一部降解RNA,可以在后面的步骤中将核苷酸也提走。
8
加等体积酚/氯仿/异戊醇,慢慢颠倒混匀,冰上平倒静置10min。
异戊醇防止液体在振摇时起泡,并能抽提部分的糖;酚可以变性蛋白质并使其沉降;氯仿可以提取脂类,液体分层。
这里得酚是tris饱和酚,这样的酚饱和了水,不会抽提水层中的水,以致将DNA一并抽到有机层。Tris还可以起到调节PH稍微偏碱的作用。
这时蛋白质沉淀于两层之间(密度的原因)。
标记离心方向,因为沉淀有时看不见,而我们吸取液体是要从沉淀的反方向。
缓慢颠倒混匀是为了减小机械剪切。
9
40C,10000rpm离心10min,用扩口枪头取出上清
因为肝脏中含有很多的酶(蛋白质),所以8,9步可重复一遍,效果较好。
用扩口枪头是为了减小机械剪切。
10
上清加等体积氯仿/异戊醇,慢慢颠倒混匀。
去除酚。
11
40C,10000rpm离心10min ,用扩口枪头取上清。
用扩口枪头是为了减小机械剪切。
12
上清加1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.2)和2倍体积的无水乙醇
脱水,因为液体中含有大量的盐(NaAc),使DNA沉淀下来,为丝状物。如果前面蛋白提取的不干净,会有弥散状的蛋白出现,应分清蛋白和DNA。
13
待DNA完全脱水而形成丝状物后,用扩口枪头吸出丝状物于另一离心管中。
14
丝状物用1mL 75%冷乙醇洗两次,每次12000rpm离心5min,弃上清。
15
超净台中稍干燥加 100uL TE, 40C溶解过夜,-200C保存。
核基因组是非常不好溶解的,所以只能稍干燥。
16
电泳:
0.3%琼脂糖凝胶 20mL(用TBE配)
4uLDNA + 4uLH2O + 1uL 10xloading + 1uL SYBR
80V 恒压电泳,凝胶成像仪观察和分析结果
基因组DNA的定量分析:
基因组DNA稀释200倍(用TE缓冲液稀释),总体积400Ul
测OD260 和 OD260 /OD280
因为核基因组很大,所以用的胶的孔径要很大,浓度仅仅是0.3%。
测OD值为选做。