基因组DNA的提取

第一节 概 述

DNA的提取通常用于构建文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。一般来说，构建文库，初始DNA长度必须在100kb以上，否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下)，并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。

不同生物（植物、动物、微生物）的DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。

本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料，学习DNA提取的一般方法。

第二节 从植物组织提取DNA

一、材料

水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。

二、设备

移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。

三、试剂

1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl，pH8.0，20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，1.5% SDS。

2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240μl巯基乙醇，加水至300ml。

3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇

4、RnaseA母液：配方见第一章。

5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。

四、操作步骤：

（一）水稻幼苗或其它禾木科植物DNA提取

1.在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ，60℃水浴预热。

2.水稻幼苗或叶子5-10g，剪碎，在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中，剧烈摇动混匀，60℃水浴保温30-60分钟(时间长，DNA产量高)，不时摇动。

3.加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，颠倒混匀(需带手套，防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟，使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。

4.室温下5000rpm离心5分钟。

5.仔细移取上清液至另一50ml离心管，加入1倍体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。

6.在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团，在干净吸水纸上吸干，转入含TE的离心管中，DNA很快溶解于TE。

7.如DNA不形成絮状沉淀，则可用5000rpm离心5分钟，再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀，往往难溶解于TE，可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。

8.将DNA溶液3000rpm离心5分钟，上清液倒入干净的5ml离心管。

9.加入5μl RNaseA(10μg/μl)，37℃ 10分钟，除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。

10.加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇，混匀，-20℃放置20分钟左右，DNA形成絮状沉淀。

11.用玻棒捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。

12.将DNA重溶解于1ml TE，-20贮存。

13.取2μl DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍，测定OD₂₆₀/OD₂₈₀，检测DNA含量及质量。

[注意] 5g样品可保证获得500μg DNA，足供RFLP、PCR等分析之用。

（二）.从李(苹果)叶子提取DNA

1.取3-5克嫩叶，液氮磨成粉状。

2.加入提取缓冲液Ⅱ10ml，再研磨至溶浆状。10000rpm，10min。

3.去上清液，沉淀加提取液Ⅰ20ml，混匀。65℃，30-60min，常摇动。

4.同本节（一）中步骤3-13操作。

第三节 从动物组织提取DNA

一、材料

哺乳动物新鲜组织。

二、设备

移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。

三、试剂

1、分离缓冲液：10mmol/L Tris·Cl pH7.4，10mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA。

2、其它试剂：10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，乙醚，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。

四、操作步骤:

1.切取组织5g左右，剔除结缔组织，吸水纸吸干血液，剪碎放入研钵(越细越好)。

2.倒入液氮，磨成粉末，加10ml分离缓冲液。

3.加1ml 10% SDS，混匀，此时样品变得很粘稠。

4.加50μl或1mg 蛋白酶 K，37℃保温1-2小时，直到组织完全解体。

5.加1ml 5mol/L NaCl，混匀，5000rpm离心数秒钟。

6.取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层后，3000rpm离心 5分钟。

7.取上层水相至干净离心管，加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。

8.移去上层乙醚，保留下层水相。

9.加1/10 体积3mol/L NaAc，及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。

10.用玻棒钩出DNA沉淀，70%乙醇中漂洗后，在吸水纸上吸干，溶解于1ml TE中，-20℃保存。

11.如果DNA溶液中有不溶解颗粒，可在5000rpm短暂离心，取上清; 如要除去其中的RNA，可加5μl RNaseA(10μg/μl)，37℃保温30分钟，用酚抽提后，按步骤9-10重沉淀DNA。

第四节 细菌DNA的制备

一、材料

细菌培养物。

二、设备

移液管，高速冷冻离心机，台式离心机，水浴锅。

三、试剂

1、CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H₂ O，缓慢加入10g CTAB，加水至100ml。

2、其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。

四、操作步骤：

1.100ml 细菌过夜培养液，5000rpm离心10分钟，去上清液。

2.加9.5ml TE悬浮沉淀，并加0.5ml 10% SDS，50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K，混匀，37℃保温1小时。

3.加1.5ml 5mol/L NaCl，混匀。

4.加1.5ml CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20分钟。

5.用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，5000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管。

6.用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提，取上清液移至干净管中。

7.加1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止10分钟，沉淀DNA。

8.用玻棒捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于1ml TE，-20℃保存。如DNA沉淀无法捞出，可5000rpm离心，使DNA沉淀。

9.如要除去其中的RNA，可以按本章第三节中操作步骤处理。

第五节 DNA的检测

上述方法得到的DNA一般可以用作Southern，RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同，得到的DNA产量及质量均不同，有时DNA中含有酚类和多糖类物质，会影响酶切和PCR的效果。所以获得DNA后，均需检测DNA的产量和质量。

1.DNA溶液稀释20-30倍后，测定OD₂₆₀ /OD₂₈₀ 比值，明确DNA的含量和质量。

2.取2-5μl 在0.7% agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小。

3.取2μg DNA，用10单位(U)HindⅢ酶切过夜，0.7% agarose胶上电泳，检测能否完全酶解(做RFLP，DNA必须完全酶解)。

如果DNA中所含杂质多，不能完全酶切，或小分子DNA多，影响接续的分析和操作，可以用下列方法处理：

（1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。

（2）酚:氯仿抽提，去除蛋白质和多糖。

（3）Sepharose柱过滤，去除酚类、多糖和小分子DNA。

（4）CsCl梯度离心，去除杂质，分离大片段DNA(可用作文库构建)。