分享“质粒DNA提取鉴定”protocal
丁香园
2090
主要试剂及溶液的配制
细菌培养基:
1)LB液体培养基:
胰蛋白胨 10克
酵母提取物 5克
氯化钠 10克
以950ml去离子水溶解，用5M的NaOH 调pH值至7.0(约0.2ml)，最后以去离子水定容至1L。高压灭菌15磅 20分钟，4℃保存。
2)LB固体选择性培养基:
LB液体培养基 1L
琼脂 15g
高压灭菌后，室温放置，待液体温度约50℃时， 加入50mg/ml的氨苄青霉素1ml，使氨苄青霉素的终浓度为50ug/ml。将培养基混匀后在超净台内分别倒入预先灭菌好的10cm2平皿铺板，培养基层2－3mm，待冷却凝固后，密封倒置于4℃保存备用。
碱裂解法提取质粒所用液体
1)溶液I:
溶菌酶 4mg
去离子水 1.4ml
500mM葡萄糖 0.2ml
100mMEDTA 0.2ml
250mMTris-HCl (pH=8.0) 0.2ml
2)溶液II:
去离子水 2.4ml
10%SDS 0.3ml
2MNaOH 0.3ml
3)溶液III:
乙酸钾 29.25g
冰醋酸 11.5ml
加去离子水至100ml
4)1M Tris-HCl缓冲液 (pH=8.0):
Tris干粉 24.24g
去离子水 191.6ml
HCl 8.4ml
5)10% SDS:
10g SDS溶于100ml 去离子水中， 于37℃水浴中使其完全溶解后室温保存。
6)5M EDTA:
取18.612克EDTA溶于50ml去离子水中， 并同时以NaOH调节pH值至8.0 (当pH值接近8.0时， EDTA才可完全溶解)， 最后定容至100ml。
7)TE缓冲液 (pH=8.0):
1M Tris-HCl缓冲液 (pH=8.0) 1ml
0.5M EDTA 0.2ml
加去离子水至100ml。
8)50mg/ml氨苄青霉素:
取0.5克氨苄青霉素溶于10ml高压消毒过的去离子水中后， 用孔径为0.22nm滤膜过滤除菌。分装后， -20℃保存。
9)5mol/l LiCl:
21.20克LiCl溶于100ml去离子水中。
10)1.6 mol/l NaCl:
4.23克NaCl溶于50ml去离子水中。
11)含13%PEG8000的1.6 mol/l NaCl溶液:
6.5克PEG8000溶于1.6 mol/l NaCl (50 ml)。
12)酚:氯仿(1:1):
等体积混合Tris平衡酚和氯仿， 现用现配。
电泳系列缓冲液
1)50×TAE:
Tris碱 242g
冰醋酸 57.1ml
0.5mol/l EDTA (pH=8.0) 100ml
以去离子水定容为1L， 4℃保存。用前1：50稀释。
2)6×凝胶加样缓冲液:
0.25%溴酚蓝， 0.25%二甲苯青FF， 30%甘油水溶液， 于4℃保存。
3)溴化乙锭溶液:
将100mg溴化乙锭溶于10ml去离子水中制成10mg/ml的储存液， 用时以0.5ug/ml的工作浓度掺入到凝胶中。
小量制备质粒DNA进行鉴定
1、用接种环从细菌冻存液（-80℃）中沾取少量菌液，点到培养皿的边缘，以其为起点直接划板于固体LB(AMP)培养皿上，37℃培养箱中（保湿）16-18小时。
2、从培养箱中取出培养皿，观察菌落的形成情况。分别挑取单个菌落接种于含6ml LB(AMP)培养液的大试管中，封口，37℃摇床（240转／分钟）培养8－12小时。
3、富集菌液，取2mL菌液加入离心管中,1000rpm，1分钟，离心。弃上清，尽量吸干。
4、用150l预冷的溶液Ⅰ将上述细菌沉淀重悬, 剧烈振荡。
5、加200l新鲜配制的溶液Ⅱ, 轻轻颠倒混匀5次,静置，使其澄清。
6、加150l预冷的溶液Ⅲ，轻轻混匀3－5分钟，使蛋白质均匀分布于水相中。
7、离心， 12000rpm 离心5min
8、小心吸取水相（约400uL）移于另一EP管中，加200uL平衡酚及200uL氯仿，混匀。
9、离心，12000rpm 3分钟。
10、取上清至另一装有1mL 无水乙醇的EP管中，来回颠倒几次，12000rpm，4℃ 离心10分钟，弃上清。
11、用70％乙醇 1mL重悬DNA（洗盐，防止以后酶切时与buffer相混）。
12、离心，12000rpm，离心3分钟，弃上清（必须吸净），37℃，室温干燥。
13、加入含RNaseA/TE 20uL, 37℃,作用6分钟。质粒DNA放置－20℃ 保存。
14、质粒DNA酶切鉴定
酶切反应体系如下：
pLXSN/TsA58 质粒DNA 10uL
Hind III 1uL
Bam H1 1uL
10× buffer K 2uL
ddH2O 6uL
离心 30秒， 37℃ 水浴 1－2小时。
15、电泳鉴定
1%琼脂糖凝胶电泳分析酶消化的DNA片段。
质粒提取试剂盒大量提取质粒
用质粒提取试剂盒（Wizard Plus Midiprepare DNA Purification System）提取。
溶解细胞：
1、取500mL锥形培养瓶，加入灭菌的液体LB细菌培养基100－200mL，按1：500的比例接种100uL小量扩增的菌液，37℃，摇床培养，200rpm／分。
2、4-5小时加氯霉素170g/ml,然后过夜（10-14小时）。
3、取过夜培养的菌液（<100ml）4℃，10,000g，10min离心细胞。倾去上清并倒置试管去除剩余液滴。［菌种保存：菌液离心后，分别加入50％ SOC与50％甘油，混匀后，分装，保存于－80℃］。
4、加入3ml细胞重悬液（Cell Resuspension Solution），完全溶解菌体沉淀。
5、加入3ml细胞裂解液（Cell Lysis Solution），倒置4次混匀。细胞悬液应立即变清。如过夜培养的菌液多于50ml或菌液未立即变清，应该室温静置3-5min（勿超过5min，否则质粒会解链为单链）。
6、加入3ml中和液（Neutralization Solution）倒置4次混匀。
7、14000g，4℃，离心15min裂解的菌液，如沉淀附着不牢固，可再以同样条件离心一次。8、将上清移入一个新试管，勿吸入白色沉淀。即刻进行下一步。
纯化质粒
1、加入10ml完全混匀的纯化树脂（Wizard Midipreps DNA Purification Resin），震荡混匀。质粒与树脂结合极快，无须静置孵育。
2、立即移入Midicolumn，以真空负压抽吸（15-18inchs Hg），直至样品全部通过Midicolumn。
3、加入15ml洗柱液（Column Wash Solution）至Midicolumn中，以真空负压抽吸（15-18 inchs Hg）。重复步骤3一次。洗柱过程约需30min。
4、液体全部抽完后，继续以真空负压抽吸（15-18 inchs Hg）30sec（切勿超过30sec，以防树脂干涸），剪除并弃去Midicolumn上段容器部分（Reservoir），将Midicolumn插入一个1.5ml的EP管中，以10,000g离心2min，去除剩余的液体。
5、将Midicolumn置于一个新的1.5ml EP管中，将300ul水或TE（如果使用TE溶解质粒，将可能抑制某些酶的活性）加入Midicolumn中，静置1min，以10,000g离心20sec洗脱DNA。 弃去Midicolumn。对于大于10kb的质粒，应将水或TE预热至65-70℃以提高产量，对于大于20kb的质粒， 应将水或TE预热至80℃。一般大小的质粒可以保存在下段中长达30min，但大于20kb的质粒会出现缺刻。以10,000g离心5min，沉淀洗脱的质粒溶液中可能残留的树脂粉末，将上清转移至一个新EP管中，于4℃或-20℃保存。并用分光光度法测定DNA的含量。
细菌培养基:
1)LB液体培养基:
胰蛋白胨 10克
酵母提取物 5克
氯化钠 10克
以950ml去离子水溶解，用5M的NaOH 调pH值至7.0(约0.2ml)，最后以去离子水定容至1L。高压灭菌15磅 20分钟，4℃保存。
2)LB固体选择性培养基:
LB液体培养基 1L
琼脂 15g
高压灭菌后，室温放置，待液体温度约50℃时， 加入50mg/ml的氨苄青霉素1ml，使氨苄青霉素的终浓度为50ug/ml。将培养基混匀后在超净台内分别倒入预先灭菌好的10cm2平皿铺板，培养基层2－3mm，待冷却凝固后，密封倒置于4℃保存备用。
碱裂解法提取质粒所用液体
1)溶液I:
溶菌酶 4mg
去离子水 1.4ml
500mM葡萄糖 0.2ml
100mMEDTA 0.2ml
250mMTris-HCl (pH=8.0) 0.2ml
2)溶液II:
去离子水 2.4ml
10%SDS 0.3ml
2MNaOH 0.3ml
3)溶液III:
乙酸钾 29.25g
冰醋酸 11.5ml
加去离子水至100ml
4)1M Tris-HCl缓冲液 (pH=8.0):
Tris干粉 24.24g
去离子水 191.6ml
HCl 8.4ml
5)10% SDS:
10g SDS溶于100ml 去离子水中， 于37℃水浴中使其完全溶解后室温保存。
6)5M EDTA:
取18.612克EDTA溶于50ml去离子水中， 并同时以NaOH调节pH值至8.0 (当pH值接近8.0时， EDTA才可完全溶解)， 最后定容至100ml。
7)TE缓冲液 (pH=8.0):
1M Tris-HCl缓冲液 (pH=8.0) 1ml
0.5M EDTA 0.2ml
加去离子水至100ml。
8)50mg/ml氨苄青霉素:
取0.5克氨苄青霉素溶于10ml高压消毒过的去离子水中后， 用孔径为0.22nm滤膜过滤除菌。分装后， -20℃保存。
9)5mol/l LiCl:
21.20克LiCl溶于100ml去离子水中。
10)1.6 mol/l NaCl:
4.23克NaCl溶于50ml去离子水中。
11)含13%PEG8000的1.6 mol/l NaCl溶液:
6.5克PEG8000溶于1.6 mol/l NaCl (50 ml)。
12)酚:氯仿(1:1):
等体积混合Tris平衡酚和氯仿， 现用现配。
电泳系列缓冲液
1)50×TAE:
Tris碱 242g
冰醋酸 57.1ml
0.5mol/l EDTA (pH=8.0) 100ml
以去离子水定容为1L， 4℃保存。用前1：50稀释。
2)6×凝胶加样缓冲液:
0.25%溴酚蓝， 0.25%二甲苯青FF， 30%甘油水溶液， 于4℃保存。
3)溴化乙锭溶液:
将100mg溴化乙锭溶于10ml去离子水中制成10mg/ml的储存液， 用时以0.5ug/ml的工作浓度掺入到凝胶中。
小量制备质粒DNA进行鉴定
1、用接种环从细菌冻存液（-80℃）中沾取少量菌液，点到培养皿的边缘，以其为起点直接划板于固体LB(AMP)培养皿上，37℃培养箱中（保湿）16-18小时。
2、从培养箱中取出培养皿，观察菌落的形成情况。分别挑取单个菌落接种于含6ml LB(AMP)培养液的大试管中，封口，37℃摇床（240转／分钟）培养8－12小时。
3、富集菌液，取2mL菌液加入离心管中,1000rpm，1分钟，离心。弃上清，尽量吸干。
4、用150l预冷的溶液Ⅰ将上述细菌沉淀重悬, 剧烈振荡。
5、加200l新鲜配制的溶液Ⅱ, 轻轻颠倒混匀5次,静置，使其澄清。
6、加150l预冷的溶液Ⅲ，轻轻混匀3－5分钟，使蛋白质均匀分布于水相中。
7、离心， 12000rpm 离心5min
8、小心吸取水相（约400uL）移于另一EP管中，加200uL平衡酚及200uL氯仿，混匀。
9、离心，12000rpm 3分钟。
10、取上清至另一装有1mL 无水乙醇的EP管中，来回颠倒几次，12000rpm，4℃ 离心10分钟，弃上清。
11、用70％乙醇 1mL重悬DNA（洗盐，防止以后酶切时与buffer相混）。
12、离心，12000rpm，离心3分钟，弃上清（必须吸净），37℃，室温干燥。
13、加入含RNaseA/TE 20uL, 37℃,作用6分钟。质粒DNA放置－20℃ 保存。
14、质粒DNA酶切鉴定
酶切反应体系如下：
pLXSN/TsA58 质粒DNA 10uL
Hind III 1uL
Bam H1 1uL
10× buffer K 2uL
ddH2O 6uL
离心 30秒， 37℃ 水浴 1－2小时。
15、电泳鉴定
1%琼脂糖凝胶电泳分析酶消化的DNA片段。
质粒提取试剂盒大量提取质粒
用质粒提取试剂盒（Wizard Plus Midiprepare DNA Purification System）提取。
溶解细胞：
1、取500mL锥形培养瓶，加入灭菌的液体LB细菌培养基100－200mL，按1：500的比例接种100uL小量扩增的菌液，37℃，摇床培养，200rpm／分。
2、4-5小时加氯霉素170g/ml,然后过夜（10-14小时）。
3、取过夜培养的菌液（<100ml）4℃，10,000g，10min离心细胞。倾去上清并倒置试管去除剩余液滴。［菌种保存：菌液离心后，分别加入50％ SOC与50％甘油，混匀后，分装，保存于－80℃］。
4、加入3ml细胞重悬液（Cell Resuspension Solution），完全溶解菌体沉淀。
5、加入3ml细胞裂解液（Cell Lysis Solution），倒置4次混匀。细胞悬液应立即变清。如过夜培养的菌液多于50ml或菌液未立即变清，应该室温静置3-5min（勿超过5min，否则质粒会解链为单链）。
6、加入3ml中和液（Neutralization Solution）倒置4次混匀。
7、14000g，4℃，离心15min裂解的菌液，如沉淀附着不牢固，可再以同样条件离心一次。8、将上清移入一个新试管，勿吸入白色沉淀。即刻进行下一步。
纯化质粒
1、加入10ml完全混匀的纯化树脂（Wizard Midipreps DNA Purification Resin），震荡混匀。质粒与树脂结合极快，无须静置孵育。
2、立即移入Midicolumn，以真空负压抽吸（15-18inchs Hg），直至样品全部通过Midicolumn。
3、加入15ml洗柱液（Column Wash Solution）至Midicolumn中，以真空负压抽吸（15-18 inchs Hg）。重复步骤3一次。洗柱过程约需30min。
4、液体全部抽完后，继续以真空负压抽吸（15-18 inchs Hg）30sec（切勿超过30sec，以防树脂干涸），剪除并弃去Midicolumn上段容器部分（Reservoir），将Midicolumn插入一个1.5ml的EP管中，以10,000g离心2min，去除剩余的液体。
5、将Midicolumn置于一个新的1.5ml EP管中，将300ul水或TE（如果使用TE溶解质粒，将可能抑制某些酶的活性）加入Midicolumn中，静置1min，以10,000g离心20sec洗脱DNA。 弃去Midicolumn。对于大于10kb的质粒，应将水或TE预热至65-70℃以提高产量，对于大于20kb的质粒， 应将水或TE预热至80℃。一般大小的质粒可以保存在下段中长达30min，但大于20kb的质粒会出现缺刻。以10,000g离心5min，沉淀洗脱的质粒溶液中可能残留的树脂粉末，将上清转移至一个新EP管中，于4℃或-20℃保存。并用分光光度法测定DNA的含量。
