流式图画十字mark时的依据
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1、流式图画十字mark时的依据是:该管的同型对照?还是细胞分群?
2005年的nature上一篇文章是按群分析的,一篇1995年的science是按同型对照来的。
nature的图片,如下:
FIGURE: Identification of subsets of CD 4 + and CD 8 + T cells in a non-human primate (rhesus macaque).a, Naive CD 4 + T cells (CD45RA + CD95 - )and two subsets of memory CD 4 + T cells (CD 4 5RA-, or CD 4 5RA+CD95+) can be identified in tissues of rhesus macaques6, 20. Before infection, most cells in the blood and lymph nodes are of the naive phenotype; however, acute SIV infection is accompanied by a selective loss of the memory subsets. LN, lymph node. b, CCR5 expression is restricted to memory T cells in both CD 4 + and CD 8 + T cells.
2、上面的图中,没有说是否用了同型对照,但是看图可以清楚地看到:
a 中的每一个region都不同,比如Inguinal LN中的Day0和Day10,两者的梯形region位置和大小都不同,那么这是根据细胞团吗?应该不是,因为从Day10的梯形region中可以看到,这不是一个细胞团,如何做出来的呢?作者认为,它是根据某个没有列出来的对照做出来的。
Mesenteric LN中也有同样的问题,两者的统计区域不同,为什么还相互比较?分析:应该是做了Day0和Day?的同时期对照,然后根据对照来设定统计region。
而 b 中也是一样,仔细看CD 4 的4张图,每个region都不一样,看来是根据细胞团划分的,但是第四张图(空肠淋巴结)是根据什么呢?肯定不是细胞团!它将细胞团从中间切开了!也不是根据上面的几种细胞,因为每种细胞都不同,在流式上没有设置区间的可比性!因此,作者认为它也是根据其(也许是同型)对照来设置的。
是根据细胞团还是同型对照。两者说的都有其基础!
搞流式技术的人当然说根据同型对照,因为流式的基本原理和相关试验的理论原理决定了,用同型对照是必须的,也是正确的!
有学者说用细胞团,作者浅薄地估计是因为多少年的试验经验告诉他,这样做的结果是一样的。但这个应该是局限于老教授的研究范围之内的,比如:做如图的CD分子表达,阴性阳性分得很开,这样应该是荧光干扰不能干扰试验结果了,所以直接按细胞团分开就可以了。从流式的原理来看,也似乎没有什么可以影响这种分法的因素,应该没问题。
但是,如果是表达量比较少的检测物,也许它们离阴性细胞的距离很近,也就是荧光强度略高于阴性对照,如果同时阴性对照局限趋势不好,那么就很难肉眼操作了。这时,用同型对照做出region或者quadrant是最合理并经得起目前理论考验的方法! 肉眼分不清时,不要强行划分,让对照来处理吧!
3、一个经验丰富的流式技术支持用自已的经验总结如下:
(1)希望结果可信,同型对照必做。
(2)调节补偿使用单标,CD 8 最好,因为细胞群分阴性、强阳和弱阳,非常明显。
(3)分析结果
1)分群明显的情况下结合其生物学意义来划分,画十字的话要同时结合密度图,等高线图和直方图来决定;也不一定非要画十字,可以画region,计算其百分比。使用如FLOWJO软件分析最好了。
2)分群不明显的时候,使用同型对照。偶的体会:大部分时候,分群明显根据群划分的marker和分群不显著时用同型对照画的得到的百分比差异比较小。
(4)需要考虑标记了不同荧光素的各抗体结合在同一个细胞上时,空间占位的问题,可能会导致某种抗体无法完全结合