PCR法检测支原体

PCR法是20世纪80年代中期建立起来的一种体外DNA扩增技术，其基本原理是酶促DNA合成反应，即在DNA模板、引物和脱氧核糖核酸存在下，经DNA聚合酶的作用，使DNA 链扩增延伸。该方法具有灵敏度高、特异性强、快速的特点，但其对实验环境的要求严格，实验成本较高，有时还有假阳性的现象出现。

1、仪器设备

超净工作台、PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、台式离心机、旋涡混悬器等。

2、实验试剂

选用美国Stratagene公司生产的支原体检测试剂盒（内有引物、阳性对照、内对照、StrataClean resin、缓冲液），dNTP，TapDNA聚合酶，缓冲液，琼脂糖，矿物油。

3、实验操作

PCR反应的前期操作应在无菌环境中进行。

（1）样品的收集：待测细胞用无双抗培养基培养7d，用无菌容器取上清液500ul，4℃保存待测。

（2）模板的制作：在无菌的条件下，取细胞培养上清100ul于一无菌的0.5ml塑料离心管内，盖好盖子，95℃水浴加热5min。

（3）打开盖子，向管内加StrataClean resin10ul，盖好盖子，旋涡混悬器混合，离心5—10s，吸取上清至一新的塑料离心管中，模板制作完毕，4℃保存。

（4）PCR反应：反应体系最适条件为：10mmol/lTris-HCL（pH8.38）；50mmol/lHCL；1.5-2.5mmol/lMgCL2；200umol/ldNTP；2UDapDNA聚合酶。总反应体系为50ul，反应用去离子水均需用12000uw/cm2紫外灯照射。反应如下表：

表 反应程序

①在0.5ml塑料离心管中加入35.2ul去离子水及5uundefined10Taq反应缓冲液。

②依次加入下列成分：0.4uldNTPs（25mmol/l），0.4ulTaqDNA聚合酶（5U/ul），2ul引物。

③加2ul去离子水，总体积45ul。

④加2ul已制成的模板到反应体系中。

⑤阳性对照，内对照各5ul加入到各自的反应体系中。

⑥取一支含有以上反应体系的离心管，加入5ul去离子水作为阴性对照管。

⑦在反应体系中加入100ul矿物油。

（5）琼脂糖凝胶电泳：PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度2%。电泳结束后，凝胶成像分析结果。

（6）结果分析：该方法为检测支原体的定性方法，在电泳泳道上，MARKER、阳性对照、内对照均会出现不同的电泳条带，当被检样品泳道出现明亮条带，且位置在阳性对照和阴性对照条带位置之间，即可认为该样品被支原体污染。有时还会发现一条泳道出现多条，可能是该样品感染两种以上支原体所致。如果泳道内条带隐约出现，则可怀疑有支原体污染，重做该样品。