PCR法检测乙肝病毒
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PCR方法操作简便,灵敏度高,可检测出少至0.1pg的目的DNA。目前已广泛应用于多种病原微生物的检测。
乙肝病毒(HBV)感染引起的乙型肝炎,在我国发病率很高,而且HBV与肝硬化、原发性肝癌关系密切,因此,HBV的诊断极为重要。PCR检测HBV-DNA敏感性明显高于传统的血清学方法,且能显示HBV在体内复制情况,直接反映患者血液的感染性,并对模棱两可的或与临床表现不符的血清学结果,PCR技术有助于明确诊断。
【材料】 待检血清、HBV-PCR反应液 20管(20μl/管)、HBV-DNA裂解液、阳性模板、溴化乙锭、PCR扩增仪、电泳仪、紫外线分析仪。
【方法】
1、标本处理:
取混匀的血清20μl加20μl裂解液,搅匀后100℃沸水浴10分钟,
最后15000rpm/分钟离心3分钟,取4μl上清待检。
2、加样及PCR:
取反应液一管(使用前稍加离心),加4μl待检上清或阳性对照于底层反应液中,混匀后高速离心片刻,然后置94℃预变性2分钟,再按94℃/30
秒、55℃/30秒、72℃/60秒扩增35个循环。
3、电泳与结果判断:
取15μl反应液,经2%琼脂糖凝胶电泳(5V/cm)30分钟后,在紫外灯下观察结果,若410bp处出现橙黄色带,则HBV为阳性。
【注意事项】
1、反应管中加好所有 试剂 后,应立即上机扩增,以免形成过多的二聚体。
2、阳性模板可用阳性 血清 代替,处理方法同上。
乙肝病毒(HBV)感染引起的乙型肝炎,在我国发病率很高,而且HBV与肝硬化、原发性肝癌关系密切,因此,HBV的诊断极为重要。PCR检测HBV-DNA敏感性明显高于传统的血清学方法,且能显示HBV在体内复制情况,直接反映患者血液的感染性,并对模棱两可的或与临床表现不符的血清学结果,PCR技术有助于明确诊断。
【材料】 待检血清、HBV-PCR反应液 20管(20μl/管)、HBV-DNA裂解液、阳性模板、溴化乙锭、PCR扩增仪、电泳仪、紫外线分析仪。
【方法】
1、标本处理:
取混匀的血清20μl加20μl裂解液,搅匀后100℃沸水浴10分钟,
最后15000rpm/分钟离心3分钟,取4μl上清待检。
2、加样及PCR:
取反应液一管(使用前稍加离心),加4μl待检上清或阳性对照于底层反应液中,混匀后高速离心片刻,然后置94℃预变性2分钟,再按94℃/30
秒、55℃/30秒、72℃/60秒扩增35个循环。
3、电泳与结果判断:
取15μl反应液,经2%琼脂糖凝胶电泳(5V/cm)30分钟后,在紫外灯下观察结果,若410bp处出现橙黄色带,则HBV为阳性。
【注意事项】
1、反应管中加好所有 试剂 后,应立即上机扩增,以免形成过多的二聚体。
2、阳性模板可用阳性 血清 代替,处理方法同上。