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SDS-PAGE,蛋白转印,western Blot试剂配制

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13831

1.5 mol/L Tris (PH8.8)

1.称量181.7g Tris置于1L烧杯中。

2.加入约800 ml去离子水,充分搅拌溶解。

3.用浓盐酸调节pH值至8.8。

4.定容至1L.

5.高压灭菌后,室温保存

注意:应使溶液冷却至室温后再调定pH值,因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大,温度每升高1oC,溶液的pH值大约降低0.03个单位。
(参照kara公司Catalog-N1)

1 mol/L Tris (PH6.8)

1.称量121.1g Tris置于1L烧杯中。

2.加入约800 ml去离子水,充分搅拌溶解。

3.按下表量加入浓盐酸调节所需的pH值。

pH值 浓HCl
6.8
7.4 约70 ml
7.6 约60 ml
8.0 约42 ml

4.定容至1L.

5.高压灭菌后,室温保存。

注意:1.溶液冷却至室温后再调定pH值,因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大,温度每升高1oC,溶液的pH值大约降低0.03个单位。2. 如1 mol/L溶液呈现黄色,应予丢弃,并置备质量更好的Tris。
(参照kara公司Catalog-N1)

30%丙稀酰胺(100ml)

1.称量下列试剂置于烧杯中。
丙烯酰胺(Acrylamide) 29 g
双丙烯酰胺 (BIS) 1 g

2.加入约60 ml去离子水,充分搅拌溶解。

3.定容至100 ml, 用0.45 µm滤膜滤去杂质。

4.于棕色瓶中4 oC保存。
注意:1. 丙烯酰胺具有很强的神经毒性,并可通过皮肤吸收,其作用具有积累性,配制时应戴手套等。聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为有可能含有少量的未聚合成分。

(参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924)

30% SDS

1.称量10 g 高纯度(电泳级)的SDS置于100~200 ml烧杯中。

2.加入约800 ml去离子水,68oC加热溶解。

3.滴加数滴浓盐酸调节pH值至7.2。

4.定容至100 ml,室温保存。

(参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924)


10% 过硫酸铵
1.称量1 g过硫酸铵。
2.加入约10 ml去离子水后搅拌溶解。
3.储存于4oC。
注意:10%过硫酸铵溶液在4oC保存时可使用两周左右,超过期限会失去催化作用。
(参照Takara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924)


1×SDS凝胶加样缓冲液
50 mmol/L Tris•Cl (pH 6.8)
100 mmol/L DTT
2% SDS (电泳级)
0.1% 溴酚蓝
10% 甘油
不含DTT的1×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温,临用前必须从1 mol/L DTT储存液中现用现加于上述缓冲液中。
(参照《分子克隆》二版P884)
本人将参照此配方,配成5×或6×,各成分浓度均扩大5倍。

另:Takara公司Catalog-N5上的5×SDS-PAGE Loading Buffer配方:
组分浓度:
250 mmol/L Tris•Cl (pH 6.8)
10% (W/V) SDS (电泳级)
0.5% (W/V) 溴酚蓝(BPB)
50% (V/V) 甘油
5% (W/V) β-巯基乙醇(2-ME)
配制量 5 ml
配制方法
1.称量下列试剂置于10ml 塑料离心管中。
1 M Tris•Cl (pH 6.8) 1.25 ml
SDS (电泳级) 0.5 g
溴酚蓝(BPB) 25 mg
甘油 2.5 ml
2.加去离子水溶解后定容至5 ml。
3.小份(500 ul/份)分装后于室温保存。
4.使用前将25 ul的2-ME加到每小份中。
5.加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右。


1 mol/L DTT (20 ml)
1.称取3.09 g DTT,加入到50 ml塑料离心管中。
2.加20 ml的0.01 M NaOAc (pH5.2),溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌。
3.分装后-20oC保存。
(参照《分子克隆》二版P884)


3 M 醋酸钠(NaOAc)(100 ml)
1.称取40.8 g NaOAc•3H2O置于100~200ml烧杯中,加入约40ml的去离子水后搅拌溶解。
2.加冰醋酸调节pH值至5.2。
3.定容至100 ml,高压灭菌后室温保存。
(参照《分子克隆》二版P884)
0.01 M NaOAc (pH5.2) 参照此配方配制。

5×Tris-Glycine Buffer(SDS-PAGE电泳缓冲液)
组分浓度:0.125 M Tris, 1.25 M Glycine, 0.5%(W/V) SDS
1.称量下列试剂置于烧杯中。
Tris 15.1 g
Glycine 94 g
10%(W/V) SDS(电泳级) 50 ml
2.加入约900 ml去离子水搅拌溶解。
3.定容至1L,室温保存。
(参照《分子克隆》二版P884)


Transfer Buffer:
[自配] Transfer Buffer:500ml
25mM Tris base, 0.2M glycine(甘氨酸), 20% methanol(甲醇PH8.5)
先配制1M Tris base (MW:121.1) 100ml: 12.1g Tris base + ddH2O至100ml,PH约11
1M 12.5ml Tris base + 7.5g glycine(MW:75.05) +100ml methanol  + ddH2O 至400ml,调好PH值,再加ddH2O至500ml.  
先置于4oC保存备用。
(参照吴兴军给Protoco, 据说优于《分子克隆》配方)


丽春红S储存液(10×)
丽春红S 2 g
三氯乙酸 30 g
磺基水杨酸 30 g
加水至100 ml。 
用1份上述储存液加9份去离子水即成丽春红S使用液,使用后应予废弃。

10X TBS (Tris-buffered saline):
To prepare 1 liter of 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl; adjust pH to 7.6 with HCl (use at 1X).
(参照Cell signal Technology Protoco)


Wash Buffer TBS/T:
1X TBS, 0.1% Tween-20
[自配] Wash Buffer TBS/T:1000ml
1×TBS,0.1%Tween-20,100ml 10×TBS+ 1ml Tween-20  + 900ml ddH2O
(参照Cell signal Technology Protoco)


Blocking Buffer:
1X TBS, 0.1% Tween-20 with 5% w/v nonfat dry milk。
[自配] Blocking buffer:150ml
for 150ml, add 15ml 10×TBS to 135 ml water,mix.Add 7.5g nonfat milk and mix well.While strirring,add 0.15ml Tween-20(100%).
(现用现配,4oC储存备用)
(参照Cell signal Technology Protoco)


Primary Antibody Dilution Buffer:
1X TBS, 0.1% Tween-20 with 5% blocking agent;
for 20 ml, add 2 ml 10X TBS to 18 ml water, mix. Add 1.0 g BSA and mix well. While stirring, add 20 µl Tween-20 (100%).
(参照Cell signal Technology Protoco)

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