免疫沉淀（immunoprecipitation）与免疫共沉淀（coimmunoprecipitation）

一、概述

免疫共沉淀（coimmunoprecipitation）是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。其原理非常简单，如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。与酵母双杂交技术不同，免疫共沉淀技术所利用的是抗原和抗体间的免疫反应，是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法。

不难看出，免疫共沉淀与免疫沉淀技术所使用的原理与方法大致相似，所不同的是，在免疫共沉淀中，对靶蛋白的结合与沉淀由另一个与之发生相互作用的蛋白替代。在免疫共沉淀或免疫沉淀的基础上，通过进一步与其它技术的结合，如聚丙烯酰胺凝胶电泳，还可进一步对靶蛋白的的分子量等特性进行鉴定。

二、 抗体的选择

多克隆抗体

多克隆抗体因其制备相对简单，可与靶蛋白分子的多个位点结合，所形成的抗原抗体复合物较稳定因而应用的最为广泛。但多克隆抗体的缺点在于非特异性结合较多，常会导致反映本底升高和一定的假阳性结果。

单克隆抗体

与多克隆抗体相比，单克隆抗体往往只结合一种抗原表位，具有单一结合特异性，所以发生非特异结合的机会少，可被用于确定靶蛋白上某一部位的特殊结构，甚至可被用于区分相同靶蛋白的不同形式如构象变化和修饰。但反过来，单克隆抗体仅与单一表位结合的特性也会引起具有同一表位的不同靶蛋白间的交叉反应。

对免疫沉淀和免疫共沉淀而言，抗体与靶蛋白间的作用力最好是刚能达到分离的效果。结合力太弱，达不到分离的目的；反之，结合力太强，不利用后续的纯化。因此，对单克隆抗体来说，其与靶蛋白的亲合力就显得尤为重要，通常，亲合力小于10 7 M － 1 的抗体就不适于免疫沉淀。

用于免疫沉淀及免疫共沉淀的理想抗体应是一组针对同一靶蛋白分子上不同表位的单克隆抗体的复合物。同时，为了保证分离效果，抗体常被事先固定在固相支持物如多聚糖凝胶颗粒Sepharose CL-4B上，或将抗体与无关的抗免疫球蛋白抗体以及能同免疫球蛋白结合的蛋白A或蛋白G连接。

免疫沉淀的靶蛋白一般来自细胞裂解液，可以是被同位素标记的也可以是未被标记的。若为前者，免疫沉淀后再经聚丙烯酰胺凝胶电泳，只需压片即可检测到靶蛋白的存在；若为后者，经免疫沉淀和聚丙烯酰凝胶电泳后，尚需借助银染或免疫印迹进行鉴定。

所需试剂及溶液

改良的RIPA液（细胞裂解液）、稀释缓冲液（常用PBS溶液）、TSA溶液、0.05mol/lTris（pH6.8）、2×SDS蛋白上样缓冲液、抗体与Sepharose或抗免疫球蛋白抗体、蛋白A、蛋白G的交联物。

改良的RIPA液的组成（100ml体系）

Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4

NP-40: 1

脱氧胆酸钠: 0.25%

NaCl: 150 mM

EDTA: 1 mM

PMSF: 1 mM

抑肽酶,亮肽酶素,抑肽素: 各1µg /ml

Na 3 VO 4 : 1 mM

NaF: 1 m