蛋白免疫印迹（Western Blot）技术手册
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1．简介
Western Blot中文一般称为蛋白质印迹。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。
2．原理
Western Blot与Southern印迹杂交或Northern印迹杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳 ，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜 ）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。其图解为：
Western Blot显色的方法主要有以下几种： i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色。现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺 ，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
3．简略步骤
4. 蛋白样本提取制备
蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项：
（1）尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）
（2）保持蛋白的处于溶解状态（通过裂解液的PH 盐浓度 表面活性剂、还原剂等的选择）
（3）提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）
（4）尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）
（5）样品分装，长期于-80 ℃中保存，避免反复冻融。
4.1细胞裂解
我们公司有针对细胞内的不同蛋白专门的蛋白裂解液试剂盒供您选择。
4.11细胞裂解操作方法：
（1）培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂。
（2）吸净PBS，加入预冷的裂解液，（(1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask; 0.5ml per 5x106 cells/60mm dish/75cm2 flask).
（3）用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，
（4）4℃摇动30 min。
（5）4℃离心12,000 rpm，10 min（根椐细胞种类不同调整离心力）
（6）轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.
4.2组织裂解
（1）用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，
（2）将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80 °C。
（3）每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml, 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml).
（4）4℃离心12,000 rpm，20 min，
轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。
4.3蛋白酶和磷酸酶抑制剂
推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL，或按下表配制：
备注：其中Sodium orthovanadate配制活化方法如下：
所有步聚均需在通风橱中进行：
（1） 用双蒸水配制100 mM 正矾酸钠溶液.
（2）用盐酸HCl 调至pH 9.0
（3）煮沸至溶液无色,尽量减少水分挥发.
（4）冷却至室温
（5）再调pH 至 9.0
（6）再煮沸至无色
（7）重复上述过程,直至溶液煮沸冷却后达pH 9.0
（8）用水定容至原体积
（9）分装保存于- 20 °C. 溶液变黄则弃之不用.
5. 蛋白定量
我们公司有不同蛋白定量的试剂盒，可满足不同实验员的需求。Bradford 法 Lowry 法或BCA 法 （操作简单、需分光光度计或酶标仪），小牛血清白蛋白 (BSA) 作为标准曲线。如果裂解液中有NP40或其它表面活性剂，则推荐使用BCA 法。三种方法或产品比较
列表如下：
6. 电泳上样样品的准备
6.1变性、还原蛋白样本
一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构（表位），因此，为使抗体能够达到结合该表位而需要将蛋白样本进行变性，使之打开折叠的空间结构，
蛋白变性一般使用含阳离子变性去污剂如SDS的上样buffer（loading buffer），并于95-100 °C 煮沸 5分钟，对于多次跨膜蛋白，可以于70 °C 加热 5-10分钟，SDS的阴离子环绕蛋白肽键使之带负电荷，蛋白分子量不同，结合的SDS数量不同，所带负电荷也不同，电泳迁移速度不同，因此SDS-PAGE电泳可将不同分子量的蛋白分离开。
6.2天然和非还原样本
某些抗体识别的表位是非连续氨基酸构成的蛋白三维结构，此种情况则需要进行非变性的WB，抗体的说明书一般会标注，这种非变性电泳不加SDS，样本也不需煮沸。
某些抗体仅识别蛋白的非还原态，如某些cysteine基的氧化态，因此loading buffer和电泳液中不加入β-mercaptoethanol and DTT。
