丁香园论坛关于显微镜问题汇总（二）（图）

yszwyd117：在2003年的一篇综述中侯春林提到显微外科未来的发展方向是应用超级显微镜，请各位高手指教：何谓超级显微镜？如何界定？应用范围？是否就是神经外科的那一种？

whoami：侯春林那篇文章主要是讲显微外科与皮瓣的。超级显微镜提了一下，是指先进的光学成像设备。

超级显徽外科技术具有三个显著的特点。
　　①使用更精细的显徽手术器械。
　　②发挥更高超的显徽操作技能。
　　③完成更细小的显徽血管吻合。

sg1150cn：我是新手，不知如何区分鸡的红细胞与白细胞，在显微镜下形态有何不同，有没有简便的区分方法？

whr75：我查了下，鸡的红细胞是有细胞核的。利用鸡的红细胞有细胞核这一特点，在DNA流式细胞术测试方法测定前要以鸡红细胞作为标准样品调整仪器的。

尘：目前手术显微镜接的都是录像机，想接数码摄录。
　　1. 有哪几款数码相机可以直接安在手术显微镜CCD接头上？
　　2. 如何将手术显微镜的摄像实时转到电脑上？看到过目乐公司有一套系统，只不过加了视频转接卡和软件，就要7万多。想自己搞，视频转接卡要哪样的好？视频转接卡有接笔记本的吗？软件有的便宜的吗？

mddcy：1、大多数名牌数码相机都有转接口可以买到，这不是问题。
　　2、我是干内科的，对手术显微镜了解不多，但给别人做过B超工作站，视频转接卡好多牌子都不错，4、5百元的就够用，但要做教学录像，最好用千元以上的专业级产品。软件用台湾友立公司的media studio最好。

sawbones：我现在正准备用共聚焦显微镜做软骨方面的课题，其中需要荧光定量胶原纤维和蛋白多糖，不知采用何种染色法比较好，据我了解应该与免疫组化的染色方法不完全相同，可到MEDLINEH上去查收获甚微，请在共聚焦显微镜方面比较熟的各位大侠帮忙。

drugking：你可以到分子探针公司的网站上去检索，网址好象是www.probes.com，你用GOOGLE搜一下就可以了。

wangzhua：Olympus，Lica，Nikon，哪家的荧光显微镜好用啊？当然还要考虑价格啊。另外，有没有必要配紫外激发光啊，我也是做细胞生物学这一块儿的。

stemyu：为什么没写Zeiss品牌？最好的应该就是Zeiss的了，当然也较贵，加上图像处理系统估计需要4～5万美元（价格跟你配的物镜关系很大）。Olympus在四种应该是最便宜的，在国内用的人也较多，能够满足一般实验的要求，大概在三万元左右。至于Lica和Nikon较olympus贵但也没有多少优势。
　　配何种激发光主要取决于你所用的染料和如何标记细胞表面marker了，我认为应该配一个。个人观点。
　　我觉得十几万元你只能买一款相对低端一点的产品了，我上面所说的价格都是各个品牌中最好的产品的价格。你可以调研一下Olympus的产品，最好是把代理商和他们的技术支持一块叫过去详细地谈谈，这样你才能更清楚。当然，调研的时候你可以多调研几个品牌，有比较才有鉴别吗。

nanshan：活细胞实验用倒置的。

culture-spirit：因为研究需要，我经常长时间使用OLYMPUS荧光显微镜的紫外激发光观察，原来还没有在意辐射问题，结果这段时间连续出现面部皮肤灼伤，很难受。请问大家有什么经验办法防止？

Yong：减少皮肤裸露应该有助于防止这种问题。

hewan：这一点你们在买仪器的时候经手人难道没有考虑么？
　　在操作平台上安装一个挡板即可，你可以向当时的销售代理商洽谈，它们可以帮助提供。不过可能会比和仪器一起买贵很多。

ybb：有那位老师用Olympus BX60 with BX-FLA Reflected Light Fluorescence Attachment荧光显微镜？我们单位有一台，但只有WB、WG自然光三种激发滤板（应该是激发滤板吧？）没有紫外光激发滤板，是不是没法观察Hoechst 33342？如果必须要紫外光滤板，哪能找到？

zhongyisheng：没错，WB观察绿色荧光，WG观察红色荧光，观察紫外必须使用相应的滤片。一般显微镜购置时都有配置，找找看？

chujun_hust：看国外的文献，他们很多细胞图中都有标尺，可以说明细胞的大小。共聚焦可以测量细胞大小，不知道在相差显微镜下如何得到这个标尺呢？我老师说可以拿计数板作为标准，对其中一个小室进行成像，然后用图像处理，得到图像上一个像素点对应的实际距离即可，但我觉得：计数板和培养瓶不在一个焦平面上，怎么能够以计数板作为标准呢？不知道大家平时是怎么得到这个scale bar的？

yuhaibo：我是在拍完照片后，在电脑上用Microsoft photo editor打开照片，这个软件有标尺，单位有厘米，英寸，像素。记住你的拍照的放大倍数。根据测量的结果除以放大倍数就是细胞的直径了。

woowoocncn：我最近要做免疫组化的半定量分析，请问，用荧光二抗好呢，还是用普通二抗好呢？另外，在做荧光免疫组化方面，用荧光显微镜好呢，还是用共聚焦显微镜好呢？文献上用的是共聚焦显微镜，能告诉我优势在哪里吗？

天之饺子：共焦点荧光显微镜与普通荧光显微镜相比，有一下优点：
　　1、Z轴上的分解能高。
　　(1)可观查被染上荧光的物质在细胞里的分布：例如，是在细胞膜上还是在细胞核里。
　　(2)即使组织标本较厚，也可获得鲜明的画像。
　　(3)可了解组织的3D结构。
　　2、高画质
　　(1)通过调节pin-hole，不但可提高Z轴上的分解能，也可提高X-Y轴上的分解能。
　　(2)可以在光学和电子两个水平调节对比度，因此可以从低对比度组织标本，拍摄到高对比度的图像。
　　3、多重染色
　　(1)多重染色时，各染料之间的cross-talk较少。
　　(2)可使用Cy5染料 Cy5的激发波长是645nm, 荧光emission波长是670～680nm, 人眼的可见光 波长是390～750nm。
　　注意点：
　　(1)注意调节Koehler illumination。
　　(2)与普通荧光显微镜一样，注意滤色镜的选择。

anqi：如果无特殊要求，还是用荧光镜，方便是其最大的优点，还便宜。你的实验只要能够说明问题就可以了，不一定非要共聚焦。当然如果你们的共聚焦用起来很方便也可以。

immu_zr：我的建议是能用共聚焦就不用普通荧光镜，说白了就两句话，共聚焦清楚，而且如果要是做多种荧光染料的标记，就只能用共聚焦了，普通荧光镜不同的荧光之间会有较强的干扰。

lsm：如果有条件的话，还是用共聚焦。结果清晰，特别是对多重荧光标记，能很好的显示。Nature等杂志的封面，很多都是共聚集的图片。如果想发表影响因子在2分以上的文章，所用的图片是荧光显微镜是不行的。不过，现在很多的共聚焦都不用注意滤色镜的选择，像徕卡的confocal就不用考虑此类问题。confocal清晰的根源在于有一个针孔（pinhole）的设置，可以将非焦平面的光阻挡，其分辨率可达0.18um。另外这种图像是真正意义上的数字图像，可进行一系列后期处理，包括3D重建，区域荧光强度的测量等等。

blueflute：实验室里的倒置相差显微镜前些日子才刚把成像系统调整好，可前两天我照相后，把底片冲出来一看（呵呵，不好意思，我们还在用很古老的相机照像），感光严重不均，肯定是轴偏了！洗照片的师傅干脆就没给洗出来。可我的细胞已经长过了，错过了最佳的照相机会，真是让人心如刀绞啊！想在这里请教各位，还能补救吗？有没有办法把像这样的图片处理一下？我想把负片扫描后调整，看看还行不行。
　　下面这张图片也是光不匀，想请大家看看能有什么办法（另外清晰度也差了些，大家见笑了）？

ddl6：photoshop
　　选择——色彩范围：高光，中间调，暗调（分别处理三种区域）。
　　选择——羽化（ 20 to 40）。
　　图像——调整：曲线及亮度和对比度。

sprac：滤镜中的高反差保留可用。

kingship：调整高反差保留的半径值！
　　我的方法是用渐变工具做的，由于时间紧没仔细做，你也可以实验。
　　新建层，选黑白渐变，然后对渐变层的透明度做调整。
　　其实我觉得对比度上不均匀和有点颗粒，我觉得还是可以忽略的，因为你那张原片右侧是暗区，是镜头轴偏或者是光线问题造成了右侧暴光不够，从而看上去被处理的图片右侧有颗粒感（颗粒的产生是由于感光材料所导致的），如果将颗粒感去掉，会损失图象的一部分细节，必定不是人像照片，所以有一点光线不均匀是可以承受的，因为我们要观察的是显微镜下的细节信息，保留细节是最关键的。如果是一张风景照片或者人像照片，那么我们就绝对有必要处理到完美。