丁香园论坛关于显微镜问题汇总（三）

chujun_hust：我现在已经筛选出高表达EGFP的细胞，我想测量细胞数量与GFP荧光强度的相互关系，我设计了一个方案：把不同个数的细胞接种到96孔板中（比如1X102～1X105个/ml），然后只利用倒置荧光显微镜测量出每孔的总荧光强度，不知道能不能测出来啊？？？？？不知道怎么测啊？或者有没有其它好方法啊？

schoman：还是用流式来测吧，比荧光显微镜方便，结果好。流式现在到处都是，而且又不需要特殊处理，只要消化处理成为单个核细胞就可以上机检测了。可以准确的检测出细胞的相对荧光强度。

lalal308：我现正在进行钙火花的测定，由于设备原因而不能测定具体困难如下：

　　1、有关MRC-1024激光共聚焦显微镜进行钙瞬时测定（即测定钙火花）的具体方法、设备的使用参数。

　　2、哪有先进的激光共聚焦显微镜，能进行钙火花的测定，并可以接受外来人员。

murong：据我所知，国内很多单位是买了激光共聚焦显微镜，而且一般都有对外服务业务，您最好说明一下自己是哪里的，那样方便战友为您提供有用的信息。

tgsslan：我要给某链霉菌用血球计数板计数，请问一定要用油镜观察吗？没有油镜的情况下，用普通的物镜可以吗？

mutongfeige：对于真菌来说，用40倍物镜进行计数应该够了，但要注意将光线调暗一点，才好观察。

yanghao：我觉得还是用油镜好，因为用高倍镜的话，不能清楚的分辩链霉菌，计数的话不准确且不能与其他的G-菌区别，如果要求不高的话当然也可以用40倍镜。如果是霉菌还可以用美兰简单染色，我是学检验的，我试过很多。

roc7464112：不要用油镜，用40倍就可以，但是要调好：灯光的亮度，彩虹光圈的大小，聚光镜的位置，一般把新把彩虹光圈调到最大，再调整灯光的亮度和聚光镜的位置，直至不太亮，再对焦，然后左手调光源大小，右手调聚光镜的位置，直至刻度线和菌都能看清楚。有必要的话还有再调一下聚焦微调。

yxssdoctor：一定不能用油镜，理由如下：当用镜检对微生物计数时，菌体较大的酵母菌或霉菌泡子应该采用血球计数板；一般细菌则采用彼得罗夫-霍泽细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，应该使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜。

celia_xl：最近我们系买了一台CONFOCAL，我想现在有很多单位都已经使用了，所以我想这些同志能否谈谈CONFOCAL的用途，使用心得，让大家也学习学习。

zxmshwo：根据我的印象，Confocal（激光共聚焦显微镜），又称为细胞CT，主要是对细胞内部结构进行定量、定性观察，和细胞内一些离子定量检测。主要适用细胞培养。

NewCureSeeker：共焦点荧光显微镜与普通荧光显微镜相比，有以下优点：

　　1、Z轴上的分解能高。

　　（1）可观察被染上荧光的物质在细胞里的分布：例如，是在细胞膜上还是在细胞核里。

　　（2）即使组织标本较厚，也可获得鲜明的画像。

　　（3）可了解组织的3D结构。

　　2、高画质

　　（1）通过调节pin-hole，不但可提高Z轴上的分解能，也可提高X-Y轴上的分解能。

　　（2）可以在光学和电子两个水平调节对比度，因此可以从低对比度组织标本，拍摄到高对比度的图像。　　

3、多重染色
　　（1）多重染色时，各染料之间的cross-talk较少。
　　（2）可使用Cy5染料 Cy5的激发波长是645nm， 荧光emission波长是670～680nm， 人眼的可见光 波长是390～750nm.
　　注意点：
　　（1）注意调节Koehler illumination。
　　（2）与普通荧光显微镜一样，注意滤色镜的选择。

xyz2942：根据不同的倍数×10，×20，×40时看到的荧光强弱，可以打+、++来表示信号的强弱。有谁知道相关的标准呢？

llhawk：+/-：高倍镜下可疑
　　+：高倍镜下隐约可见
　　++：高倍镜下较明显
　　+++：低倍镜下明显可见
　　++++：低倍镜下刺眼

jchenone：我直接在目镜下面拍摄，但是效果较差，请问有什么好的办法？

ylcui：在倒置镜专门接相机的位置，把普通相机卸下，数码相机镜头对准那里（最好能加工一个接圈），效果一般还可以。但是这种变通方式得到的照片，也不是特别理想。

murong：注意在摄影接口那里是否配有摄影目镜，有的显微镜只有接口，没加摄影目镜（可选件）。那么你可以去厂家买一个。

pimaster：我是用DiI-acLDL检测内皮细胞，由于它是细胞的功能检测，必须是活细胞实验，之后置于共聚焦观察。我已经作过一次，是用DiI-acLDL加入培养基中，于常用细胞培养条件2～3小时后，直接用共聚焦观察，使用浓度按试剂说明。可是没有结果！因为是第一次，我不知到错在哪！请教各位能给我指点么？

czh4：你是通过检测什么指标反映功能变化的？我估计存在以下问题：
　　1、试剂问题，由于你讲的不清楚，你自己考虑下。
　　2、内皮细胞活性：由于是活细胞实验，细胞功能上首先必须是正常的；我不知道你做的是什么实验，最终是通过检测什么指标反映功能变化的，但我想道理都是一样的。解决方法是设立阳性对照，通过加入其它刺激剂，上调或下调内皮细胞功能，观察你所检测指标有无变化，如此时亦无变化，则很可能说明你培养的细胞功能上存在问题。
　　举例说明：我曾在共聚焦下做过内皮细胞内钙离子浓度测定，有时上样后亦无反应，通过加入上调细胞内钙离子浓度的A23187或下调剂后，亦无反应，则说明问题很可能出在细胞本身。
　　顺便问一句，你是在什么装置内培养细胞的？据我所知，一般培养瓶是很难在共聚焦载物台上进行操作的。

roosterjian：建议你将盖玻片铺在培养皿内，贴壁后实施预刺激等，加入染料待细胞摄取，然后取出来，固定，观察。另外，共聚焦的镜头通常是短工作距离的（小于1mm，为提高分辨率），要是在培养皿里观察必须用特殊的培养皿，厚度和盖玻片一样必须满足镜头的工作距离。我通常是先用长工作焦距的落射荧光镜观察，然后铺片上共聚焦。