丁香园论坛关于显微镜问题汇总（一）

火流：偏振光显微镜和相差显微镜是不是一种东西？

goooogle：偏光一般用在看矿石，晶体等非生物样品上，在生物学领域用的很少。相差是一种增加对比度的方法。可以在不染色的情况下看到活体细胞。

goooogle：显微镜哪个牌子好？

Fang CY：当然是日本的OLYMPUS了，不过价钱也很好了。

JianH：功能最多、质量最佳的是德国莱卡，但价格最高；最便宜的是日本OLYMPUS，质量居中；价格合适的是日本Nikon。

jihongy：求教那位知道共聚焦显微镜细胞培养中如何应用？

nwuyw：如果你将用的confocal microscope是载物台运动扫描（镜头在底下），则细胞必须是贴壁很牢的；如果是激光束运动扫描方式，则只要细胞能够沉淀在培养皿底部即可。注意培养皿底部要是很薄的玻璃片形式的。

新手小猪：共聚焦显微镜可以让你清楚地看到细胞各个层面，所以有利于细胞内蛋白质以及细胞器的定位（当然，这些必须是经过标记你才能看到）。

victor2002：观察普通免疫荧光（FIAT）的荧光显微镜可不可以用来观察细胞自发荧光吗？我用pEGFP质粒转染HepG2细胞，不知可不可以用观察普通免疫荧光的荧光显微镜观察？还是必须用其他更高级的荧光显微镜呢？

armstrong：当然可以观察的到，不过你没事观察细胞自发荧光干什么？应该尽量减少自发光。只要你的荧光显微镜配置的滤光片的波长范围把488nm和507nm（EX and Em，respectively）罩住即可了。

yjr923：请教奥林帕斯与尼康哪个品牌的显微镜更好一些？

llhawk：推荐使用NIKON或者LEICA的显微镜。特别是LEICA的显微镜，小巧，方便，性能好。

goldenearth：我欲做卵母细胞培养急需体视显微镜，不知国产的那个牌子比较好？20，40倍，不需连续变倍。价格多少的可用？

goooogle：德国莱卡有一款才8100块人民币，投射光反射光都有，体积也小巧，可以放在无菌台里操作。4～40倍放大。

小卫：我的一台荧光显微镜（带CCD的），最近拍片老是看上去有脏东西，刚开始以为是目镜，但擦过还是没用，后来发现是CCD上脏了。我采用了很多种方法擦洗好象都擦不了，不知道怎么办。有没有好的解决方法呀？

中国龙之心：镜片模糊可以用二甲苯处理。

topgun99：常规处理显微镜可以用二甲苯，但荧光显微镜（CCD）最好谨慎些，具体的方法应该咨询生产厂家。

cornea：有谁知道哪里有比较好的电子显微镜方面的书？

little：你可以看看《细胞超微结构病理》凌冶萍主编 上海医科大学出版社；《实用生物医学电子显微镜技术》杨勇骥主编 第二军医大学出版社；这两本书对生物样品制样和电镜原理都有介绍。

slpg：《生物电子显微镜技术》张景强，朴英杰，等编著，中山大学出版社。比较实用。

fhsuperman：由于实验需要，打算买一台解剖显微镜，用来做小鼠ES细胞的分离。主要是要小巧，功能没必要很多，大家给推荐几个？

NewCureSeeker：仅从使用上来讲，请注意几个问题：
　　1、你的要放大多少倍？
　　2、如果您除了搞ES cell，还用该显微镜做解剖、搞原代培养，请注意显微镜镜身不要太高，不然显微镜放在超净台里时，操作不方便（有的厂家将电光源安在显微镜的载物台下，也有的显微镜本身不带电光源，而另配电光源）。

goooogle：莱卡有一款适合你的工作。它4～40倍无级放大。有透射光和反射光两种。可以用来观察培养细胞。并且体积足够小巧大小才高30cm宽25cm。并且价格相对与昂贵的其他型号来说很便宜的才8100人民币。

尘：科里准备买一台神经外科手术显微镜，承受价格70～80万人民币左右，大家根据使用经验，推荐一下？

shouxf：目乐和蔡司不错。保养是关键。

little2000：Zeiss NC4功能强大，美国Barrow的Spetzler最喜欢。Leica OHS-1也很好，天坛的赵继宗教授专用。

cilia：不知道共聚焦显微镜主要用于什么？是否观察细胞组织的立体结构？价格大约多少？

wasteam：激光共聚焦显微镜用途：
　　观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换。
　　应用范围：
　　一、细胞生物学：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞结构和发布变化。
　　二、生物化学：酶、核酸、FISH（荧光原位杂交）、受体分析。
　　三、药理学：药物对细胞的作用及动力学。
　　四、生理学：膜受体、离子通道、细胞内离子含量、分布动态。
　　五、神经生物学：神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递、递质受体、离子内外流、神经组织结构、细胞分布。
　　六、微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态构成。
　　七、病理学及临床应用：活检标本的诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病的诊断、HIV等。
　　八、遗传学和组胚学：细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断。

changqing112：我在实验中设想利用激光共聚焦显微镜来观测单个细胞中的通道蛋白分布情况，不知需要的抗体有何要求？必须是单克隆抗体吗？如果抗体是普通的抗体，那该如何检测呢？

土人：你说的是免疫荧光染色的方法吧？
　　免疫荧光染色跟免疫组化差不多，差别就在于前者是用的荧光染料（如cy2、cy3、FITC等）标记的二抗，在荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜下观察荧光；而后者则是用的直接显色的方法，在普通光镜下或者肉眼下直接就可以看到信号。
　　免疫荧光染色不一定要用单抗，多抗也可以的。只要是可以用来做免疫组化的抗体都可以的——注意，有的抗体能用来做western bot，却不能做免疫组化，这一点要小心。
　　所用的二抗要求是抗-抗来源种属IgG的、用荧光染料标记的二抗。做完后要及时在与荧光染料对应的激发光下镜检并照相。
　　具体操作红皮书（分子生物学实验精编）上的“免疫细胞化学”一章节有介绍。

yongmingwu：原来我们科里照相用的都是普通相机，显微镜是Olympus Vanox的，现在想接一个数码相机来拍照。请问各位用过数码相机拍照的站友们，选择什么样的相机比较好？购买和安装时有什么特别要注意的地方吗？

18852：我们科里用的是尼康可旋转式数码相机，其镜头可以任意角度进行旋转，非常方便，另外要注意与显微镜上有一个配套的套筒，与镜头相接。使用十分方便！

gzhuangzq：关键要看是谁出钱了：
　　若是公家买，那就买和纤维镜配套的专用相机，价格嘛，当然很贵！
　　若是自己买，就目前市场，有两钟机型好选择：尼康Coolpix995和尼康Coolpix4500，前者现已停产。因此，目前就只有一个机型很适合用于显微镜拍照！
　　优点：1.相机镜头与显微镜的目镜相差不大，相机镜头不会被目镜“刺伤”。
　　2.再镜头变焦过程中，相机镜头前端长度始终无变化，这非常适于显微镜拍照！
　　3.价格现已由刚上市的5000多元降为4000元以下了。
　　4. 400万像素。
　　建议：同时购进一小的三角架，高度比显微镜高即可。在拍摄的时候就很容易稳定、双手操作、影像清晰，没有那么累。

qxbgx：必须用专用的数码相机才可拍摄完整清晰的照片。
　　放在目镜上视野极小，而且焦距也对不准。
　　显微镜上配套的套筒与镜头相接是必须的。
　　目前国内好像只有Olympus有卖专用显微照相的数码相机。

tudou：我们单位有人买了olympus显微镜，我要用这个东西了，但是发现没有照相机。我想配个照相机，最好是数码的，起码方便，但是我到电脑市场一打听，好像数码相机都没有原来普通相机的那种接口。那位英雄有经验，请指点迷津？

ibp_hust：如果资金可以的话，建议装CCD，照相机的效果还是不如CCD，有否接口要看你的显微镜型号，倒置IX系列还是其他，另外也要看你的成像要求，像素和图像分辨率，作荧光的话还是CCD，照相机不能作出好的图片效果！

jamesxia：因为我们的实验条件有限，而且是公共实验室，照相不方便，所以我尝试用数码相机直接拍摄显微镜的目镜图像。感觉虽然比不上用转接环直接接在显微镜上的相机，但是也勉强能看清结构了。
　　如果要求不高，或者可以考虑这样简单的方式。
　　大家可以看看我拍的原代照片。细胞状态不好，但是拍出来很清楚，核仁和胞浆的颗粒还是很清楚的，只不过背景似乎太暗，对比不强烈。
　　显微镜是：olympus的倒置显微镜。
　　数码相机是：Fujifilm F401。

goodfreecn：我们试验室有一台olympus BHF的荧光显微镜，只有一个压制滤板（在目镜的下面，应该是压制滤板吧？），型号为0530。我要观察EGFP的荧光，其激发波为488nm，发射波为508nm，不知道能否观察？

chujun_hust：压制滤板？应该是装filter cube的转盘，上面可以安装几个filter cube，每一种filter cube对应一种荧光燃料，这样可以同时观察几种荧光染料的荧光，不知道你实验室的是什么样的filter cube（excitation filter是什么类型的，DM是什么类型的，emission filter是什么类型的），你可以上olympus网站上查这个filter cube的型号，查出它的filter cube具体参数，再对照你的EGFP本身的激发和发射光谱进行检验。
　　下图为filter cube的构造图。

goodfreecn：谢谢chujun_hust的帮助，我对荧光显微镜知道的甚少，我所指的压制滤板，应该是barrier filter，但我也不是100%的肯定，我描述一下吧，一个塑料板，中间为圆形的黄色的滤片，可以插进去，也可以把出来，标号为0530。
　　我们的excitation是这样标的：U，V，B，G，O，O。关于DM和emission filter，我不知道，因为没有说明书。
　　0530是否表示只有530nm以上的光可以通过？

chujun_hust：（1）excitation是这样标的：U，V，B，G，O，O。
　　激发波段的简写，一般UV指的是紫外，V：紫，BV：蓝紫，B：蓝，G：绿，Y：黄。
　　（2）关于DM和emission filter，我不知道，因为没有说明书。
　　可以通过google查到具体参数吧，我想作为一个研究生，这么简单的都搞不定？
　　（3）0530是否表示只有530nm以上的光可以通过？
　　你要查到0530的资料才能确定，因为我对这款荧光显微镜不了解。
　　我们这边的的荧光显微镜为Olympus IX70，观察GFP的filter cube是专门为GFP设计的，具体参数如下：
　　Ex filter：425～475nm（汞灯光源经过此滤光片后出来的激发光波段范围）。
　　DM：480LP（大于480nm的光都通过次二色片，所以激发光不能通过，因为小于480，而GFP能通过）。
　　Em filter：485～535nm。

ligzh2003：上次我做DIL的荧光逆行标记细胞，就是没有结果，标记不上去，一个老师在镜下找到是绿色的，但我记得师姐拍的是红色的，网站上标的也是红色的。
　　我怀疑是试剂失效，我就点了一滴试剂在玻片上，直接看有无红色，结果有红色，这说明了两个问题：
　　1、试剂有效。
　　2、实验没结果要找其他原因。
　　所以我建议你：现在找不到资料，有EGFP的话，直接在玻片上点几点，观察有无预计的荧光出现，当然，玻片要先看过后在点，排除玻片的荧光，如果没有，就换一种染料。

小于：我想知道显微镜下的视野大小，我如何做呢？

我还想活下去：首先你要确定你所使用的物镜的放大倍数，因为物镜的放大倍数，观察到的视野也会变的，可以用血球计数板来做一个标准（血球计数板上的小格子的距离是固定的）来确定镜下的视野大小。

ch111666：谁能帮我提高使用显微镜的技巧，血球计数板的使用，我想听听您的经验！我有时光线调得不当而看不清，培养基干扰大，区分不清。如何区分芽孢、细菌、放线菌、酵母等，有经验的可以一眼就可看出是否染菌、哪些是芽孢、细菌、放线菌、酵母等。而我不能，谁能帮我？

fengcaiyun：(1) 对于血球记数板使用，你可以先采用10倍目镜，物镜采用15倍，首先在视野中找到网格，然后调整物镜到自己所需要的倍数。
　　(2) 对培养基干扰图象的问题，可以先低速离心去除固形物等。
　　(3)一般情况下，区分芽孢、细菌、放线菌和酵母，可以采用不同的染色方法，而酵母细胞直径最大，而细菌最小，而芽孢菌多存在分散的孢子，而放线菌多粘连。

yuwei76121：想请教大家一个弱弱的问题：我将做一些有关细胞骨架蛋白表达情况的实验，拟采用免疫荧光技术。但是我不知道荧光显微镜和激光共聚焦显微镜在显示蛋白表达上有什么差别呢？是不是后者的观察结果会更清晰一些呢？目前我们实验室还没有激光共聚焦显微镜，那么能否在荧光显微镜下观察拍照，对结果是否有很大的影响呢？

ttf：其实激光共聚焦显微镜就像CT一样，如果只是了解蛋白表达情况没有太大差别，当然其观察结果会更清楚。

scs18：激光共聚焦显微镜就像细胞CT，把细胞的一个个层面都扫了一下，结果非常清晰，比荧光显微镜要清楚。荧光显微镜拍下来，细胞层叠比较多，看得不是太清楚。但是如果只是看细胞骨架蛋白表达情况，对结果没有有很大的影响。

源一：激光共聚焦显微镜原理：它是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。主要系统包括激光光源、自动显微镜、扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜、检测器）、数字信号处理器、计算机以及图象输出设备（显示器、彩色打印机）等。通过激光扫描共聚焦显微镜，可以对观察样品进行断层扫描和成像。因此，可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。
　　同时，通过激光扫描共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具.精确地对光谱的本质进行分析，区分发射光谱高度重叠的不同标记的信号。
　　最重要的是，对于多色的荧光染色，它能彻底消除了荧光串色的影响，同时最大限度的减少了样品荧光信号的损失。这些都是一般光镜所不能达到的。

小于：新手在做FISH时，荧光的观察用有B，G两种滤片的显微镜（NIKON，型号为UFX-Ⅱ），可以吗？

dropboy：您所用的B和G两种滤片是激发滤光片（Excitation filter），位于光源和标本之间，作用时允许特定波长的光通过，以激发标本中的荧光物质。至于FISH，得看您用什么荧光标记，然后看看是否在您的激发滤光片的激发波长范围内，或者，您看看您的激发滤光片的激发波长是什么，然后选择荧光标记物做FISH。