如何寻找转录起始位点
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引物延伸分析用于定量mRNA的量，测定低丰度的mRNA的种类。另外引物延伸实验可标定转录产物的5`-端， 确定转录的精确起始。特异的末端标记的引物退火到RNA链的互补区域，随后用RNA作为模板，用反转录酶延伸引物得到cDNA，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析cDNA。
cDNA的长度为引物的标记的核苷酸到RNA-5`末端间的碱基数，所得cDNA的量和目的RNA的起始量成正比。理想的引物是ssDNA，长度为20-40个核苷酸，与要分析的转录产物的5`末端区域互补。延伸产物小于150个核苷酸，可得到最佳分离效果。引物延伸实验非常灵敏，可检测2 pg的转录产物，这相当于1个细胞中的1个RNA。引物延伸实验非常适合于对单个基因作定量和定性分析。
2. 引物延伸系统的组分：引物延伸系统中AMV反转录酶和反应溶液、焦磷酸钠、正对照RNA模版和对照引物、去磷酸的PhiX174Hinf I DNA 标准分子参照物、T4多核苷酸激酶和溶液、样品溶液、AMV反转录酶2X溶液100 mM Tris-HCl（pH8.3， 42℃）、100 mM KCl、 20 mM MgCl2、20 mM DTT、2 mM每一种dNTP、1 mM精胺。PhiX174标准分子参照物和T4 多核苷酸激酶用作引物标记，和确定延伸产物长度的标准。
对照RNA可得到87个碱基的延伸产物作为正对照。引物延伸反应中用焦磷酸钠和精胺可增加全长cDNA的得率，抑制模板RNA产生发卡结构。虽然其作用方式未确定，但结果是增加全长cDNA的得率，抑制模板RNA产生发卡结构。MMLV被焦磷酸钠和精胺抑制，如使用MMLV，放线菌素D可用于增加全长cDNA的得率，抑制模板RNA产生发卡结构。焦磷酸钠和放线菌素D抑制cDNA第二条链的合成。
（1）杂交温度。引物延伸实验中所用的杂交温度是最关键的需优化的因素。一般而言，最高紧密度，或引物和互补序列完全杂交所需的最适条件是，低于引物溶解温度的5℃。低于最高紧密度的温度可极大地增加杂交速度。
应在不同的紧密度的杂交温度下作杂交，以控制引物和特异RNA的杂交。增加杂交紧密度时，带来的延伸产物的丢失表明，引物和相关的却不是等同的转录产物杂交。在碱和双价阴离子的存在下，RNA在较高温度会降解，应用甲酰胺杂交操作方案，这可有效降低溶解温度，因此可使杂交在较低的温度进行。可在杂交步骤中用以下的溶液：40 mM PIPES、1 mM EDTA、0.4 mM NaCl、80%的甲酰胺。如用这个杂交溶液，延伸步骤前甲酰胺和盐需用乙醇沉淀后除去。
（2）模板RNA和引物的量。以下讨论了所用RNA模板和引物的起始量。反转录酶对不同模板使用的效率不同。这部分是由于RNA中存在的次级结构干扰反转录酶的聚合酶活力。如产生短的产物，这通常不是一个问题。如用AMV反转录酶，延伸温度可达55℃。
（3）每次反应所用RNA的量。每次反应所用RNA和引物的量取决于分析的RNA的种类（总RNA或poly(A) + RNA），目的RNA的相对丰度。如用总RNA，起始量为10 ug，但分析稀有信号，每次反应用100 ug RNA。poly(A)+RNA每次反应用0.1-1.0 ug，具体决定于总RNA中poly(A)+RNA的富含量，需分析的特异RNA的浓度。在引物延伸分析前需检查目的RNA的完整。通过凝胶分析总RNA，应有完整的18S和28S核糖体RNA带。在引物延伸反应中用Northern印迹和RT-PCR分析来确定特定RNA的存在。
（4）每次反应所用引物的量。用引物延伸实验定量RNA，标记的引物必须多于目的RNA。引物应是互补RNA的5-10倍。但一般，总RNA或poly(A)+RNA中，特定目的RNA量未知。对未分析的转录物，初次分析用50 ug 总RNA和100 fmol 引物。如所有RNA中与引物互补的位点饱和，测试信号和投入的RNA的量成正比，而不依赖于引物的浓度。引物应至少为20个核苷酸，杂交位点应位于转录产物5`-末端下游的100个碱基处，而不会自互补。也可用从限制性酶切片段所得的ssDNA作为探针，长度应不长于50-100个核苷酸，以获得最佳分辨率。
（5）AMV和MMLV的选择。引物延伸反应通常用AMV，AMV性能更好，对次级结构耐受。用AMV的延伸温度可达55℃， 以消除次级结构，但在这样温度下，引物延伸反应的得率通常降低。MMLV的最适温度为37 ℃，在更高温度下，MMLV不稳定，但MMLV可合成更长的产物，这一特点对引物延伸反应不适用，因引物延伸反应所得的产物一般较短，为100-500个核苷酸。
（6）会导致非特异，短的和多个引物延伸产物的影响因子：所研究的转录的差异程度可导致产生不同长度的延伸产物，它们来源于选择式剪切和使用不同的转录起始位点。差异核RNA的存在也能导致产生多个延伸产物。引物和RNA中相关或无关序列的交叉杂交也会导致非特异延伸产物的产生。产物短于预测可能和RNA模板的降解有关，或者是转录产物中次级结构阻制了反转录酶的合成，产生断缺的cDNA。RNA样品中存在DNA污染同样可得延伸产物，加放线菌素D（75 ug/ml）可抑制这类产物的产生。应作无RNA模板的负对照实验，以确定所用试剂中无RNA和DNA污染。同时还应用从不表达目的转录产物的细胞或组织中提取的RNA模板作负对照实验。
4. 计算RNA转化为cDNA的量。RNA转化为cDNA的量可对引物延伸产物，和`无RNA`对照实验的cpm作测量得到。从凝胶中分别切割引物延伸产物和`无RNA`对照实验中产物，在闪烁液中测定凝胶块的读数，可有效平衡聚丙烯酰胺凝胶的湮灭和32P的衰退。以下的例子表明如何计算fmol的RNA转化为cDNA，在这个例子中，一半的引物延伸产物（20 ul/40 ul）加入凝胶中作分析。`无RNA`对照实验的引物浓度为100 fmol，一半的反应液加入凝胶中作分析。切割的带的读数为：样品为3912 cpm，引物为142359 cpm，首先计算引物cpm/ fmol：cpm/ fmol=142359 cpm/[100 fmolX（20/40）]=2847 cpm/ fmol，接下来计算引物延伸产物的fmol，或cDNA：3912 cpm/[2847 fmolX（20/40）]=2.75 fmol cDNA。所得值表明引物延伸中所得的cDNA的量。
三种不同的核酸酶——S1核酸酶、RNA酶、外切核酸酶VII被用来进行RNA定量，确定内含子位置，及鉴定在克隆的DNA模板上mRNA的5`-末端和3`-末端的位置。含有目的mRNA的RNA样品与互补的DNA或RNA探针在利于形成杂合体的条件下温育。
在反应的末期，用核酸酶用来降解未杂合的单链RNA和DNA。余下的DNA-RNA或RNA-RNA杂合体用凝胶电泳分离，接着用自显影或Southern杂交来观察。当探针的摩尔数在杂交反应中过量时，信号强度与样品中目的mRNA的浓度成正比。用过量探针与一系列定量的靶序列杂交作出标准曲线，从而可准确估算样品的浓度。在真核系统中，S1核酸酶消化过的5`-末端通常代表转录起始点，而3`-末端代表聚腺苷酸化的位点。同样的策略可用来对拼接位点的5`-末端和3`-末端作图
