Western Blot 中如何选择内参抗体

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Western Blot

Western Blot 即免疫印迹试验，可以利用 Western Blot 来比较在不同条件下，不同细胞组织中目的蛋白表达量的差异，属于定性，半定量试验。既然有差异性比较，参照物必不可少。Western Blot 试验中的标准（表达量）参照物即内参，有了参照物才能准确地比较目的蛋白表达量的差异。内参一般选用管家基因表达的蛋白，它们在各个组织细胞中表达相对恒定，不会因为外部条件变化而引起表达量的变化。而且内参可以监测整个试验体系是否正常，比如蛋白提取过程，转膜体系，显色体系等。

beta Actin、beta Tubulin、GAPDH、Lamin B1、PCNA 等已作为成熟的内参运用到试验中，下面就大致介绍下如何选择内参：

样本来源

● 如果是哺乳动物的组织或细胞，主要以 beta Actin、beta Tubulin、GAPDH、Lamin B1、PCNA 为代表；

● 如果是植物样本，主要以 actin、Rubisco 为代表。

目的蛋白定位

● 全细胞蛋白和细胞质：beta Actin、beta Tubulin、GAPDH 等；

● 细胞核蛋白: PCNA 等；

● 核膜蛋白：Lamin B1 等；

● 胞膜蛋白：Na(+)/K(+) ATPase 等。

目的蛋白分子量

beta Actin、beta Tubulin、GAPDH 的分子量分别是 42kd，50kd，37kd，目的蛋白分子量最好能与内参蛋白分子量相差 5kd 以上，才能分开目的蛋白和内参，写文章做图也更美观；

三大内参

beta Actin，肌动蛋白，细胞骨架蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。beta Actin 作为内参是得到公认的，针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞质内，表达量非常丰富。但是在一些少量特殊的情况下比如脂肪组织和细胞内，beta Actin 的表达量就很少。

GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，该酶是糖酵解反应中的一个酶，几乎在所有组织细胞中都高水平表达，在同种细胞或组织中的表达量一般是恒定的，且很少受外部诱导物的影响。但比如缺氧和糖尿病等疾病存在下，会增加 GAPDH 在特定细胞和组织中的表达。

beta Tubulin，微管蛋白，细胞骨架蛋白。作为内参抗体，beta Tubulin 表达通常不会发生改变，因此被广泛用于 Western Blot 内参，也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。

下面是多年项目经理在开发抗体时的一点心得，希望对大家有帮助。

1. 不同的内参在选择上也要根据具体的样本情况选择，没有一种内参能适用所有的组织和细胞样本。比如，血红细胞（因为其细胞结构的特殊性和需要携带氧气的功能性）样本就不适合以上 3 种常用内参。如果使用会导致结果很差或者没有结果。可以选用血红细胞的结构性蛋白作为内参代替。

2. 在做多组织多细胞样本对比表达量时，最好选用 GAPDH 作为内参，因为 GAPDH 是代谢类蛋白，在活组织中表达比较恒定。而 beta Actin 和 beta Tubulin 是结构蛋白，不同组织的细胞结构会有差异性，如脑组织的 tubulin 的表达会高一些（因为神经细胞的轴突和树突都由 tubulin 维持结构），而 actin 的表达量可能会低一些。再比如，骨骼肌、心肌和平滑肌的特殊功能反而导致了 tubulin 的表达改变和特化。心肌的 beta Actin 的表达量可能变少，而 alpha Actin 表达量高。因为这些组织的差异，现在慢慢采用总 Actin 和总 tubulin 作为内参，可以尽量减少一些组织表达量差异。

3. 做各种分泌液样本的时候，如血浆，乳汁，组织液等，以上的 3 种内参也不是很合适。由于没有完整的细胞结构，所以只能选择一些分泌蛋白作为内参，或者采用其他方式作为内参。

4. 做诱导后样本或检测磷酸化等修饰性抗体时，选择结构蛋白作为内参，如 beta Actin 和 beta Tubulin。因为 GAPDH 是代谢类蛋白，表达量有可能会受到诱导处理的影响。同时，做修饰性抗体的 Western Blot 实验，最好也带上同抗原的总抗作为阳性对照。

5. 做 Western Blot 实验时，内参的条带强度也要适当控制。不要让内参条带发生过度曝光的情况，尤其是用 X 胶片曝光的。如果内参条带过度曝光，条带会显得很宽，妨碍对条带正确强度的判读，进而影响对其他实验结果的判断。最好的内参结果是： 窄窄的，黑色实心条带。