Western Blot试验选择内参抗体的重要性

相关专题

Western Blot内参抗体产品选择专题

检测一个基因 的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是western blot 。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……

毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用的。

我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。艾美捷向您推荐使用内参抗体来检测您的实验系统，或者校准您的实验结果。

内参即是内部参照(Internal Control)，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白 的表达水平变化时常用它来做参照物。

在Western Blotting 中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。

此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

实验结果分析其实很简单：如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。

如果样品量充分，可以先检测内参，观测样品间内参显色条带是否一致，根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western Blotting实验，至内参量一致为止;若内参一致，即可进行不同样品间目的蛋白表达 变化分析。这样虽然麻烦一点，但是可以保证结果更有说服力，更可信。毕竟我们的实验是一种严谨的工作。

常用的细胞总蛋白质内参有GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)和细胞骨架 蛋白beta-actin或beta-tubulin，这其中最近的国外文献报道中使用GAPDH内参的较多。

对于一些植物的样本，则需要特别的植物Actin蛋白作为内参;同样的，如果提取的样本是细胞核蛋白，那么PCNA或者组蛋白H3都是被经常使用的;而针对一些研究线粒体的客户，那么Cox IV则被较多的文献引用作为线粒体总蛋白的内部参考。