Western－Blot的试验要点
丁香园论坛
2318
由于本人刚刚进入实验室，没有任何经验，不知道各位大哥能否给于指导，告知具体的实验注意点。谢谢各位大侠
Cx43、Cx40蛋白表达的测定
2.6.1血管组织的匀浆
取血管标本100mg置玻璃匀浆器中，按100mg/ml的比例加入裂解缓冲液，4℃下手工碾磨10-15分钟至肉眼看不到组织碎片，置离心管中于4℃低温离心机以14000ram离心15分钟，取上清液分装保存在-70℃深低温冰箱备用。
2.6.2 蛋白浓度的测定
用Bradford 比色法测定，分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白（5，10，15，和20ul），以0.15mmol/L NaCl 补足至100ul。同时以两管100ul的0.15mol/L NaCl作空白对照管，每管各加入1ml考马斯亮蓝染料溶液，遮挡混匀，室温放置2min，用1cm光经的微量比色杯测A595，取A595吸光值对标准蛋白作图，画出标准曲线，回归系数R必须大于0.99，然后测量待测样本A595，从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度，样本浓度过高则在稀释后再测定。
结果如下：
血清白蛋白 （ul） 5 10 15 20
0.15mmol/L NaCl (ul) 95 90 85 80
考马斯亮蓝染料溶液（ml） 1 1 1 1
A595吸光值 0.073 0.152 0.200 0.278
血清白蛋白（ug） 2.5 5 7.5 10
2.6.3 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳
1） 分离胶的制备
分离胶配制如下表
不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）
溶液成分（12%） 5 10 15 20
水 1.6 3.3 4.9 6.6
30%丙烯酰胺溶液 2.0 4.0 6.0 8.0
1.5mol/L Tris 1.3 2.5 3.8 5.0
10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2
10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2
TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008
2) 分离胶配制好后迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注积层胶所须空间（梳子的齿长再加1cm），上面注入去离子水。
3) 分离胶聚合完全后（30分钟），倾出覆盖层液体，用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙烯酰胺，再用纸巾的边缘吸净残余液体
4）制备积层胶，配方如下
不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）
溶液成分 2 3 4 5 6
水 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1
30%丙烯酰胺溶液 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0
1.0mol/L Tris 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75
10%SDS 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
10%过硫酸铵 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
TEMED 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006
5) 在已聚合的分离胶上直接灌注积层胶，立即在积层胶溶液中插入干净的梳子。避免混入气泡，再加入积层胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。
6) 当积层胶发生聚合时，把样品置于1×SDS凝胶加样缓冲液
中（比例2:1），在100℃加热3分钟以使蛋白质变性。
7) 积层胶完全聚合后（30分钟），小心移出梳子，使用注射器针头用去离子水洗涤加样槽以除去未聚合的丙烯酰胺，把凝胶固定于电泳装置上，上、下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。
8）按预定程序加样，每样品加15ul（蛋白量为20ug），最后在所有不同的样品孔中加上等体积的1×SDS凝胶加样缓冲液。
9） 将电泳装置与电源接上，用100V电压电泳，当染料前沿进入分离胶后再加电压至180-200V，继续电泳至溴酚蓝至分离胶低部，关闭电源。
10） 从电泳装置上卸下玻璃板，放在纸巾上。用刮勺撬开玻璃板，标明方位。即可用于Western印迹法。
2.6.4 Western blot 步骤
1）凝胶电泳完成后，将凝胶放到去离子水中漂洗一下，开始电转膜，取6张滤纸和1张硝酸纤维滤膜，大小均与凝胶一致，滤纸放在转移缓冲液中，滤膜放在去离子水中，使之湿润，在阴极上放置3张用转移缓冲液浸泡过的滤纸，逐张叠放，精确对齐，然后用玻璃管作滚筒以挤出所有气泡，把凝胶放在滤纸上，要保证精确对齐，而且在滤纸与凝胶之间不留有气泡，然后将硝酸纤维滤膜准确平放凝胶上，做好标记，最后把3张滤纸放在凝胶上方，使各层精确对齐排除气泡，然后用200mA电流在4℃下转膜90分钟。
2）取出硝酸纤维滤膜，在TBST液中短暂漂洗1分钟，然后放入含5%脱脂奶粉的TBST中封闭，室温下摇晃1小时。
3）用TBST洗膜3-4次，每次15-20分钟。
4）将硝酸纤维滤膜置一抗中（一抗浓度1:1000）在摇床上温育1小时，然后置4℃ 冰箱中过夜。
5）再用TBST洗膜3-4次，每次20-30分钟，时间2小时。
6）将硝酸纤维滤膜置羊抗兔IgG二抗溶液中（浓度1:1000），在摇床上摇晃1小时。
7）再用TBST洗膜3-4次，每次20-30分钟，时间2小时。
8）ECL 显影
取等量ECL A液和B液（可根据滤膜面积0.125ml/cm2）混合，将滤膜在溶液中温育1min，沥干膜。用保鲜膜包裹后，置暗盒中，曝光2秒-60分钟。
2.6.5 内参的测定
将上述滤膜放入抗体洗脱液中10分钟，取出滤膜，在TBST液中漂洗5分钟，然后放入含5%脱脂奶粉的TBST中封闭，室温下摇晃半小时，再重复洗膜、一抗结合(抗Actin单克隆抗体)、洗膜、二抗结合、洗膜、显影等过程。
2.6.6蛋白印迹的分析
用Epson彩色图像扫描仪获取蛋白质信号条带图像后，用Kodak凝胶图像分析仪、Kodak Digital Sience 1D 2.0 软件进行信号分析，以Actin蛋白的光密度值进行标准校正，计算Cx43、Cx40蛋白产物的相对量。计算公式：Cx43、Cx40蛋白相对量＝Cx43、Cx40蛋白产物条带密度/Actin蛋白产物条带密度。
由于本人刚刚进入实验室，没有任何经验，不知道各位大哥能否给于指导，告知具体的实验注意点。谢谢各位大侠
Cx43、Cx40蛋白表达的测定
2.6.1血管组织的匀浆
取血管标本100mg置玻璃匀浆器中，按100mg/ml的比例加入裂解缓冲液，4℃下手工碾磨10-15分钟至肉眼看不到组织碎片，置离心管中于4℃低温离心机以14000ram离心15分钟，取上清液分装保存在-70℃深低温冰箱备用。
2.6.2 蛋白浓度的测定
用Bradford 比色法测定，分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白（5，10，15，和20ul），以0.15mmol/L NaCl 补足至100ul。同时以两管100ul的0.15mol/L NaCl作空白对照管，每管各加入1ml考马斯亮蓝染料溶液，遮挡混匀，室温放置2min，用1cm光经的微量比色杯测A595，取A595吸光值对标准蛋白作图，画出标准曲线，回归系数R必须大于0.99，然后测量待测样本A595，从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度，样本浓度过高则在稀释后再测定。
结果如下：
血清白蛋白 （ul） 5 10 15 20
0.15mmol/L NaCl (ul) 95 90 85 80
考马斯亮蓝染料溶液（ml） 1 1 1 1
A595吸光值 0.073 0.152 0.200 0.278
血清白蛋白（ug） 2.5 5 7.5 10
2.6.3 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳
1） 分离胶的制备
分离胶配制如下表
不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）
溶液成分（12%） 5 10 15 20
水 1.6 3.3 4.9 6.6
30%丙烯酰胺溶液 2.0 4.0 6.0 8.0
1.5mol/L Tris 1.3 2.5 3.8 5.0
10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2
10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2
TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008
2) 分离胶配制好后迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注积层胶所须空间（梳子的齿长再加1cm），上面注入去离子水。
3) 分离胶聚合完全后（30分钟），倾出覆盖层液体，用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙烯酰胺，再用纸巾的边缘吸净残余液体
4）制备积层胶，配方如下
不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）
溶液成分 2 3 4 5 6
水 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1
30%丙烯酰胺溶液 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0
1.0mol/L Tris 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75
10%SDS 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
10%过硫酸铵 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
TEMED 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006
5) 在已聚合的分离胶上直接灌注积层胶，立即在积层胶溶液中插入干净的梳子。避免混入气泡，再加入积层胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。
6) 当积层胶发生聚合时，把样品置于1×SDS凝胶加样缓冲液
中（比例2:1），在100℃加热3分钟以使蛋白质变性。
7) 积层胶完全聚合后（30分钟），小心移出梳子，使用注射器针头用去离子水洗涤加样槽以除去未聚合的丙烯酰胺，把凝胶固定于电泳装置上，上、下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。
8）按预定程序加样，每样品加15ul（蛋白量为20ug），最后在所有不同的样品孔中加上等体积的1×SDS凝胶加样缓冲液。
9） 将电泳装置与电源接上，用100V电压电泳，当染料前沿进入分离胶后再加电压至180-200V，继续电泳至溴酚蓝至分离胶低部，关闭电源。
10） 从电泳装置上卸下玻璃板，放在纸巾上。用刮勺撬开玻璃板，标明方位。即可用于Western印迹法。
2.6.4 Western blot 步骤
1）凝胶电泳完成后，将凝胶放到去离子水中漂洗一下，开始电转膜，取6张滤纸和1张硝酸纤维滤膜，大小均与凝胶一致，滤纸放在转移缓冲液中，滤膜放在去离子水中，使之湿润，在阴极上放置3张用转移缓冲液浸泡过的滤纸，逐张叠放，精确对齐，然后用玻璃管作滚筒以挤出所有气泡，把凝胶放在滤纸上，要保证精确对齐，而且在滤纸与凝胶之间不留有气泡，然后将硝酸纤维滤膜准确平放凝胶上，做好标记，最后把3张滤纸放在凝胶上方，使各层精确对齐排除气泡，然后用200mA电流在4℃下转膜90分钟。
2）取出硝酸纤维滤膜，在TBST液中短暂漂洗1分钟，然后放入含5%脱脂奶粉的TBST中封闭，室温下摇晃1小时。
3）用TBST洗膜3-4次，每次15-20分钟。
4）将硝酸纤维滤膜置一抗中（一抗浓度1:1000）在摇床上温育1小时，然后置4℃ 冰箱中过夜。
5）再用TBST洗膜3-4次，每次20-30分钟，时间2小时。
6）将硝酸纤维滤膜置羊抗兔IgG二抗溶液中（浓度1:1000），在摇床上摇晃1小时。
7）再用TBST洗膜3-4次，每次20-30分钟，时间2小时。
8）ECL 显影
取等量ECL A液和B液（可根据滤膜面积0.125ml/cm2）混合，将滤膜在溶液中温育1min，沥干膜。用保鲜膜包裹后，置暗盒中，曝光2秒-60分钟。
2.6.5 内参的测定
将上述滤膜放入抗体洗脱液中10分钟，取出滤膜，在TBST液中漂洗5分钟，然后放入含5%脱脂奶粉的TBST中封闭，室温下摇晃半小时，再重复洗膜、一抗结合(抗Actin单克隆抗体)、洗膜、二抗结合、洗膜、显影等过程。
2.6.6蛋白印迹的分析
用Epson彩色图像扫描仪获取蛋白质信号条带图像后，用Kodak凝胶图像分析仪、Kodak Digital Sience 1D 2.0 软件进行信号分析，以Actin蛋白的光密度值进行标准校正，计算Cx43、Cx40蛋白产物的相对量。计算公式：Cx43、Cx40蛋白相对量＝Cx43、Cx40蛋白产物条带密度/Actin蛋白产物条带密度。
由于本人刚刚进入实验室，没有任何经验，不知道各位大哥能否给于指导，告知具体的实验注意点。谢谢各位大侠
