western blot试验心得
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前两天做了一个western blot,现在把试验中的一点小小的体会发上来,与大家交流,希望大家多多指点!
1 本实验室采用的脱脂奶粉已经存放了近两年了,虽然是四摄氏度保存,但是其封闭质量还是难以保证的。所以本人的试验结果中出现了小斑点。建议最好使用BSA或专用的脱脂奶粉进行封闭,虽然贵点,但还是有个好点的结果比较好。
2 本人采用的是过夜封闭方法,虽然时间长,想想封闭效果应该是没有什么问题,但是一定要注意封闭液是否盖过了全部的膜,不要漏掉任何一个小角落哟。
3 洗膜的时候,最好将膜放在平皿中,置于水平的试验桌面上,不时用手晃动一下平皿,这样洗膜会比在脱色摇床上更完全。因为在脱色摇床上晃动,有时洗涤液不足以完全没过膜,在最后显色的时候,会发现液体流过的一道道痕迹,使背景值增加。
4 其实在western blot中,以上操作都是小问题,最主要的是一抗的质量和待检测蛋白的提取质量。在试验之前,最好先用阳性对照与一抗做免疫学沉淀检测(如ELISA),看看其效价和质量,以便确定在后来的杂交试验中一抗的选择和加量。另外,在做杂交之前最好也先跑一块PAGE胶,染色,检测一下待检蛋白的提取质量。
5 在加一抗温育之前,最好先将等量的一抗与野生型(即阴性对照)的蛋白在37摄氏度作用30分钟,这样可以封闭掉一抗的一些非特异性结合位点。
6 一定不要忘记做阴性对照和阳性对照,特别是阴性对照,不然结果出了什么问题,就无从分析了。
7 全程做下来,最后的显色就像是个一锤定音的时刻,分外激动,但也应该尤为专注,一旦目的条带出现了,就要马上对显色进行终止,要不然杂带就要出来了。
1 本实验室采用的脱脂奶粉已经存放了近两年了,虽然是四摄氏度保存,但是其封闭质量还是难以保证的。所以本人的试验结果中出现了小斑点。建议最好使用BSA或专用的脱脂奶粉进行封闭,虽然贵点,但还是有个好点的结果比较好。
2 本人采用的是过夜封闭方法,虽然时间长,想想封闭效果应该是没有什么问题,但是一定要注意封闭液是否盖过了全部的膜,不要漏掉任何一个小角落哟。
3 洗膜的时候,最好将膜放在平皿中,置于水平的试验桌面上,不时用手晃动一下平皿,这样洗膜会比在脱色摇床上更完全。因为在脱色摇床上晃动,有时洗涤液不足以完全没过膜,在最后显色的时候,会发现液体流过的一道道痕迹,使背景值增加。
4 其实在western blot中,以上操作都是小问题,最主要的是一抗的质量和待检测蛋白的提取质量。在试验之前,最好先用阳性对照与一抗做免疫学沉淀检测(如ELISA),看看其效价和质量,以便确定在后来的杂交试验中一抗的选择和加量。另外,在做杂交之前最好也先跑一块PAGE胶,染色,检测一下待检蛋白的提取质量。
5 在加一抗温育之前,最好先将等量的一抗与野生型(即阴性对照)的蛋白在37摄氏度作用30分钟,这样可以封闭掉一抗的一些非特异性结合位点。
6 一定不要忘记做阴性对照和阳性对照,特别是阴性对照,不然结果出了什么问题,就无从分析了。
7 全程做下来,最后的显色就像是个一锤定音的时刻,分外激动,但也应该尤为专注,一旦目的条带出现了,就要马上对显色进行终止,要不然杂带就要出来了。