western blot注意事项

蛋白质从 SDS 聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜（湿式转膜）

1）SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后，小心取出带有凝胶的玻板，用割胶刀沿下边缘小心撬开短板，按样品的多少切下合适大小的凝胶。浸泡在转膜缓冲液中 5 分钟左右，以平衡离子强度。视情况决定是否切角标记。

2）电用结束前，应泡好 3M 滤纸 2-6 张均可（普通滤纸也可）和 1 张硝酸纤维素滤膜。

3）戴上手套按如下顺序安装转移装置：

a. 平放底部电极（阴极），放一张海绵垫片。

b. 在海绵垫片上放置 1-3 张用转移缓冲液浸泡过的滤纸，逐张叠放，对齐，然后用一玻璃棒作滚筒以挤出所有气泡，必要时可滴加转膜液润湿。

c. 取出浸在转膜液中的凝胶平放于滤纸上。排除所有气泡。

d. 把硝酸纤维素滤膜放在聚丙烯酰胺凝胶上，在硝酸纤维素滤膜与聚丙烯酰胺凝胶之间不留有气泡。

e. 把最后 1-3 张滤纸放在硝酸纤维素滤膜上方，同样须确保不留气泡。其实，用玻棒给点压力很容易排除气泡。

f. 放上另一张或几张海绵垫片，盖上阳极板，夹紧。保证对凝胶有一定的压力。

4）连接电源。我做 90KD 的蛋白，电转移 100 分钟，电压 100v。电转过程中，尽量给个低温环境，我放在冰水里转膜，也用内置的冰盒。

5）断开电源，拆卸转移装置，逐一掀去各层。将凝胶转移至盛有考马斯亮蓝染液的托盘中，进行染色，可检查蛋白质转移是否完全。要观察膜上蛋白的情况可在丽春红中染色 3-10 分钟，然后蒸馏水冲洗。

6）切去滤膜的左下角，以标记，如有预染 MARKER 也可不标。

7）杂交与显色：

① 封闭

② 一抗孵育：分别与相应的抗体及内参照抗体孵育

③ 漂洗：室温下以 TBST 液在平缓摇动条件下漂洗 3 次以上，每次各 10 min。

④ 与二抗孵育：与辣根过化物酶标记的二抗孵育

⑤ 漂洗：室温下以 TBST 液在平缓摇动条件下漂洗 4 次以上，每次各 10 min。

⑥ ECL 显像

⑦ 显影定影完毕

常见问题：

1、两快玻璃板之间灌胶, 胶为什么总是不平?

1) 玻璃没有洗干净，应该要洗得非常干净！

2) 过硫酸铵和 TEMED 的加量不合适，加量相对较多，凝胶凝固过快也会胶不平，最多按照分子克隆加倍。

3) 加完试剂以后没有很好的摇匀，导致有些部位的聚合剂浓度过高，聚合相对较快造成胶不平。

4) 稍微注意手法，均匀加入。

5) 灌胶后应该用水或者正丁醇压胶面。

6) 边缘胶是不容易聚合完全的，灌完胶后要立即加无水正丁醇覆盖，浓度越低的胶越不要使用双蒸水压顶，另外还可以在压顶试剂如正丁醇中添加少许 AP 来增加边缘胶的凝聚强度。

7) 温度也是影响胶聚合的重要因素，可能为了让胶更快的凝固而把胶放到 50 度的温箱，由于受热不均匀，也会造成胶聚合不均匀。

2、胶为什么总是漏？

1）每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件。

2）避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损很重要，尤其是下面和胶条接触的地方。

3）关键是找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐就行了。

4）胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。

5）下面的胶条注意不要老化，如果有裂纹的话用保鲜膜垫在上面，也可以有效防止漏胶，或者反过来用。

6）玻璃在使用过程中容易造成小的缺口，从而导致封条无法完全密封，装好架子后，在玻璃底边上抹上一层薄薄的凡士林就好了，两边多点（容易从两边漏）这样就不会漏了，就算是用了很久的很多小缺口的玻璃都没有问题，然后转移到电泳槽的时候，去掉封条，把底上的凡士林擦干。

（注意，一定要擦干净，尤其是少量进入了两隔玻璃之间空腔的，因为凡士林不导电，会影响电泳的效果。）。

7）可以在海绵垫下再垫一些纸，使得它与玻璃贴的更紧密。或者在玻璃底部用琼脂糖封上。

8）因为两块玻板没有放的完全对齐，底部不在同一个平面，所以封条封不严，重新对齐后就不漏了。以后每次只要在水平的桌面上仔细对齐两块玻板，再夹紧。用手感觉一下确定在同一平面上后，放到灌胶架并压在封条上，卡紧。注意两边均匀用力，一般不会再漏。

9）先把两块玻片放在夹子上，不要加紧，放到架子上，使两块玻片的底部对齐，夹紧两块玻片，然后取下再在其下面垫上垫片，这样一般就不会漏胶了。

3、条带跑得比正常的窄？

1）可能因为胶凝的不均匀，聚合的不是很好，灌胶的时候尽量混匀.

2）可能与拔梳子有关，拔梳应该迅速，冲洗加样孔的时候要小心，以免把上样带扭曲；胶配好了用枪吹几下再灌胶，还有就是要等指示剂跑到两层胶交界成一线时，再调高电压。

3）可能是样品的问题，如果盐浓度较高，便会挤压其它条带，致使条带宽窄不一，由于同样的原因，样品在凝胶中的速度会很慢，造成条带走的较慢。

4）常见的原因是：每孔上样量不均匀，应确保每孔中上样量一致。

5）可能是系统的 ph 出了问题，有可能是电极缓冲液，也有可能是凝胶缓冲液，更新缓冲液。

4、为什么会有「微笑」和「倒微笑」这样的效果呢？

1）"微笑"是因为灌胶的时候冷却不均匀，中间部分冷却不好，导致凝胶中的分子有不同的迁移率所致。这种情况在较厚的凝胶以及垂直电泳时常常发生。「倒微笑「也称「皱眉」现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的三明治底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象

2）书上说出现「微笑」是因为整个胶冷凝的不均匀，中间部分和两端受热不一样而致成了「倒微笑」可能是因为两端的胶凝的不好，加 APS 和 TEMED 后应该混合均匀。

3）样品中盐浓度过高？点样量太多或每孔点样量不均匀？电泳电压不稳定或过高

5、Western-blot 制胶时好多泡泡怎么办？

1）首先，玻璃板一定要洗干净，用洗洁净洗，冲干净后再用双蒸水冲一，晾干。配胶的时候沿管壁缓缓加入各个成分，混匀的时候用手轻轻摇匀，如果用枪吹打时要缓慢且不要打到头。

2）配胶时混匀要轻，尽量不产生气泡，上胶时要快，枪也不打到底。加完分离胶后用双蒸水封，待其凝固。即使在上胶时液面上有气泡，加水后也会浮上来。分离胶凝好后，倒掉里面的水，用吸水纸吸干，再加浓缩胶，迅速插梳子。

3）倒胶的时候，用 1 ml 的枪沿一侧缓缓加入，不要打到头，以免带入气泡！

4）将胶在小烧杯里配好后，将电泳槽略微倾斜，将烧杯的嘴靠在玻璃边缘，直接倒进去，速度快 ，而且不容易产生气泡，不妨试试

5）用双蒸水封时建议用 200ul 的枪加水，这样压力小，以免把胶冲起来！

6）国产的只能是缓慢加样，别把气泡加进去。如果加进去了，小心把整个板在桌上敲敲可以让气泡浮上来。

7）分离胶中的气泡与插梳子有关，垂直插容易产生气泡，且不容意排除。将梳子倾斜 5-10 度插入，即使产生气泡也可以也可以通过轻轻晃动梳子使气泡从一侧逸出。

8) 还有一个制胶起泡泡的原因，就是配胶的液体全部在四度存放，室温制胶时由于温差及凝胶聚合反应放热的关系，液体中微小的气泡在凝固的凝胶中也会放大成可见的较大的泡泡，这种情况在夏天室温较高时更容易出现。避免的方法是将制胶成分中除催化剂外的部分配置后放室温下静置一会儿，减小温差后再加入催化剂制胶。

6、凝胶肿胀或卷曲

注意转膜之前，切割下来的凝胶一定要在转膜缓冲液中浸泡平衡 5-10 分钟，要含有 20% 的甲醇。

7、条带歪斜、或漂移 因为转膜仪使用时间太长，两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄。

当按照阴极-海棉-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵依次放好后两块板不能压紧，因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙，电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走。使用十几张普通的草纸垫在两块海棉之间，条带就可以变得非常的漂亮。 另外，转膜时转膜液一定要浸没凝胶和膜，否则也可能出现上述情况。

8、膜上单个或多个白点 转膜时在膜与胶之间有气泡。

做三明治时一定要逐层压紧，赶尽气泡。同时转膜液要提前配置好，加好甲醇，保证转膜前夜体内气泡排净。气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜，降低转膜效率。

9、转膜缓冲液过热 缓冲液离子强度太低，或电压及电流过高，同时转膜过程中注意降温。

10、背景过高

1）封闭不全。

2）一抗或者封闭液与膜蛋白的交叉反应。

3）一抗或二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。

4）抗体浓度太高，或孵育时间太常都可能遇到这种情况。

5) 曝光时间的控制。

11、没有信号

1) 用单抗时比较容易出现这种情况。

2) 蛋白的表达量

3) 蛋白转膜效率

4) 一抗二抗的效价问题

12、微量进样器堵了怎么办？

首先从预防入手，每次用后的进样器及时用蒸馏水清洗！

如果堵了，不要紧，有办法：可以用如下办法解决：

1）首先反复推拉上样针，看是否可将堵塞物吹出来；

2）方法 1 不灵，若是 25 或 50ul 的针，把针从后侧拔出，然后重新插入，使其内部产生气压，可能压出堵塞物质；

3）如上述方法不灵可以在拔出后注入些清水，然后重新插入，用水压排出，

4）最后的方法，最灵的方法：开始步骤同第 3 种方法中，在加入水后，将上样器的前端针部放在酒精灯上煅烧至红色（估计在什么位置堵的）。

注意 烧红部分不要距离玻璃过近，然后，趁热突然推 针，将水强行推出，通道打开后，再通过稀酸或稀碱冲洗即可！

5）或者放在超声清洗仪里，超声试试 注意，切记在推拉过程中小心不要把针弄弯

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