RFLP和RAPD技术原理和操作步骤

原理：

　　 DNA 分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism, 限制片段长度多态性 ) 已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。 RFLP 是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的 DNA 水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。

所用的探针为来源于同种或不同种基因组 DNA 的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记 (Mark) ，构建分子图谱。当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。

分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组 DNA 后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。常用的限制性内切酶一般是 Hind Ⅲ， BamH Ⅰ ,EcoR Ⅰ ,EcoRV,Xba Ⅰ , 而分子标记则有几个甚至上千个。分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是 RFLP 研究的主要目标之一。

　　运用随机引物扩增寻找多态性 DNA 片段可作为分子标记。这种方法即为 RAPD(Random amplified polymorphic DNA ，随机扩增的多态性 DNA) 。尽管 RAPD 技术诞生的时间很短 , 但由于其独特的检测 DNA 多态性的方式以及快速、简便的特点 , 使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。该 RAPD 技术建立于 PCR 技术基础上 , 它是利用一系列 ( 通常数百个 ) 不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链 ( 通常为 10 聚体 ) 为引物 , 对所研究基因组 DNA 进行 PCR 扩增 . 聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离 , 经 EB 染色或放射性自显影来检测扩增产物 DNA 片段的多态性 , 这些扩增产物 DNA 片段的多态性反映了基因组相应区域的 DNA 多态性。

RAPD 所用的一系列引物 DNA 序列各不相同 , 但对于任一特异的引物 , 它同基因组 DNA 序列有其特异的结合位点 . 这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合 PCR 扩增反应的条件 , 即引物在模板的两条链上有互补位置 , 且引物 3' 端相距在一定的长度范围之内 , 就可扩增出 DNA 片段 . 因此如果基因组在这些区域发生 DNA 片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化 , 而使 PCR 产物增加、缺少或发生分子量的改变。

通过对 PCR 产物检测即可检出基因组 DNA 的多态性。分析时可用的引物数很大 , 虽然对每一个引物而言其检测基因组 DNA 多态性的区域是有限的 , 但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此 RAPD 可以对整个基因组 DNA 进行多态性检测。另外， RAPD 片段克隆后可作为 RFLP 的分子标记进行作图分析。

　　本实验将学习 RFLP 的酶切 , 电泳和膜的制作以及 RAPD 技术。探针标记及杂交检测方法请另详见分子杂交技术。

RFLP 技术

　　一、 材料
　　基因组 DNA( 大于 50kb, 分别来自不同的材料 ) 。

　　二、设备
　　电泳仪及电泳槽， 照相用塑料盆 5 只，玻璃或塑料板 ( 比胶块略大 ) 4 块，吸水纸若干，尼龙膜 ( 依胶大小而定 ) ，滤纸 ， eppendorf 管 (0.5ml) 若干。

　　三、试剂：
　　 1 、限制性内切酶 (BamH Ⅰ , EcoR Ⅰ , Hind Ⅲ , Xba Ⅰ ) 及 10 ×酶切缓冲液。
　　 2 、 5 × TBE 电泳缓冲液：配方见第一章。
　　 3 、变性液： 0.5mol/L NaOH ， 1.5mol/L NaCl 。
　　 4 、中和液： 1mol/LTris ・ Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl