人外周血中性粒细胞制备

(一)小量分离法

[试剂及配制]

(1)6%右旋糖酐生理盐水

(2)聚蔗糖-泛影葡胺分层(D=1.077)

(3)0.83% NH4 Cl溶液：取0.83g NH4 Cl、0.1g KHCO3 、0.0037g EDTA.Na2，蒸馏水加至100ml。

(4)0.1%白明胶Hank’s液。

[操作方法]

(1)取3～10ml肝素抗凝血，加1/4体积的6%右旋糖酐生理盐水，混匀后在室温静置30～45min，使红细胞下沉；

(2)取上层细胞按1：1比例叠加到聚蔗糖-泛影葡胺分层液面上，500r/min离心30min；

(3)将沉淀细胞用0.83% NH4 Cl溶液破坏红细胞，离心洗涤后，悬于2～3ml 0.1%白明胶Hank’s液中，计数并调整细胞浓度；

(4)取细胞液涂片，分别作台盼蓝拒染试验和Giemsa染色，鉴定其存活率与纯度。

(二)大量中性粒细胞的分离方法

[试剂及配制]

(1)Percoll：将购买的Percoll(Pharmacia)用10×HBSS(无钙、镁)按9:1的体积比配成储备液，该浓度被认为100%。再用1×HBSS(含10mmol/L HEPES,pH7.2)将100%的Percoll稀释成81%、70%、55%的浓度备用，其密度分别为1.100、1.0875和1.0697。

(2)葡聚糖：将Dextran T-500 用PBS配成4%的浓度。

(3)离心梯度的配制：取将5ml 81%的Percoll加入17×100mm的离心管底，然后依次加入3ml 70% Percoll和4ml 55% Percoll即可。

[操作方法]

(1)将全血 3000r/min离心3～5min；

(2)取40ml淡黄色细胞层与4% Dextran混合；

(3)5min后，将80ml 2% Dextran加入悬液中，然后将混悬液倒入50ml的离心管中，让其自然沉淀30min；

(4)取Dextran沉淀后的“上清部分”，150g离心8min，并用PBS洗涤2次；

(5)将细胞（约5×106 /ml）加入梯度离心的最上层(即55% Percoll层)，10℃，1600r/min离心20min；

(6)离心后将产生3条细胞带，其中带2中性粒细胞约占96.5%；

(7)取出细胞，用HBSS洗涤后配成所需浓度。