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多克隆抗体的提取纯化

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一、批量提取法

称取DEAE-纤维素(DE32或DE52)50g,置于1000ml烧杯中,先以蒸馏水漂浮除去细颗粒,再经酸碱处理后,用0.01~0.05mol/L,pH8.0左右的磷酸盐缓冲液(PB)平衡。将水分抽干,或用布氏滤斗(内放两层滤纸)过滤,收集湿纤维素,以降低其离子强度。按1ml血清加湿重5g DEAE纤维素,经过充分搅拌,置4℃吸附1h。上清液可再如此处理一次,即获得较纯的IgG。该法提取IgG简便,既可小量提取,也可大量制备。

二、Tris-Cl离子交换层析法(Ion-exchange chromatography)

材料和试剂

1. DE32或DE52纤维素。

2. HCl;NaOH;0.01~0.05mol/L,pH8.0 PB;0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl;0.5mol/L NaCl。

3. 待纯化标本:杂交瘤腹水或培养上清,免疫血清或饱和硫酸铵粗提品。

4. 1.5×50cm 层析柱;透析袋;紫外分光光度计及其他透析和层析所需的试剂和器材。

操作步骤

1. DE52纤维素的处理:DE52经酸、碱处理,0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl平衡。

2. 装柱:将层析柱固定于滴定架上,柱底垫一圆形尼龙纱,出口接一细塑料管并关闭出水。将浸泡于0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl中的DE52沿玻璃棒倒入柱中,待DE52自然沉降3~5cm高时,吸除0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl,或松开出水口螺旋夹,控制流速1~2ml/min,同时连续加入DE52至所需高度。待DE52完全沉降后,柱面放一圆形滤纸片。

3. 平衡:松开出水口螺旋夹,以0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl平衡,控制流速为15滴/min,待流出液与洗脱液之pH值达到一致时,停止平衡。

4. 待提取样品的准备:将蛋白装入透析袋里,置4℃冰箱,对0.01mol/L pH8.6 Tris-Cl透析过夜。

5. 加样、洗脱与收集:用吸管吸去柱面液体,以毛细吸管沿柱壁加入样品,样品体积相当于柱床体积的1%~2%,蛋白浓度为50~70mg。启开出水口螺旋夹使样品缓慢进入柱床内,并用少量洗脱液清洗柱壁;待液体进入柱床后,以0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl洗脱,控制流速为14~16滴/min。分部收集器收集,紫外监测,或人工收集,以紫外分光光度计分别测定每管280nm OD值,描绘洗脱液峰。

6. 浓缩:将洗脱液的280nm OD上峰段与下峰段各管分别合并,装入透析袋,以PEG浓缩至所需体积。

三、Tris-PO4 离子交换层析法

该法在上述方法的基础上稍加改良,即通过梯度洗脱,可用于血清中IgG和IgM的提取。

材料和试剂

1. DE32或DE52纤维素。

2. 待纯化标本:杂交瘤腹水或培养上清,免疫血清或饱和硫酸铵粗提品。

3. 1.5×50cm 层析柱;透析袋及其他透析和层析所需的试剂和器材。

4. 梯度洗脱液包括:0.005 mol/L,pH8.6 Tris-PO4 ;0.055mol/L,pH6.0 Tris-PO4 ;0.5mol/L,pH5.1 Tris-PO4 。

操作步骤

1. 蛋白标本对0.005mol/L,pH8.6 Tris-PO4 透析。

2. DE52装柱,并以0.005mol/L,pH8.6 Tris-PO4 平衡。

3. 加样,以0.005mol/L,pH8.6 Tris-PO4 洗脱,紫外监测直至洗脱液280nm OD回到基线。这一步骤可除去血清中其他蛋白。

4. 以350ml 0.055mol/L,pH6.0 Tris-PO4 洗脱,这一步骤可用于纯化血清IgG和IgM。

5. 以125ml 0.055mol/L,pH6.0 Tris-PO4 和125ml 0.5mol/L,pH5.1 Tris-PO4 梯度洗脱,总量收集250ml;重复步骤(5)。

6. 根据280nm峰值合并蛋白峰,透析浓缩和保存同上。

用过的DE52可用0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl和0.5mol/L NaCl、0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl梯度洗脱回收。再用蒸馏水洗至中性,加入0.02%叠氮钠于4℃保存备用。

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