鸡卵泡颗粒细胞分离、培养

1.实验动物

产蛋期母鸡（动物实验中心购买），普通饲料喂养，自由进食进饮；实验前禁食12h

2.主要试剂及仪器

EDTA-2Na购自国药集团化学试剂有限公司；
双抗购自Hyclone公司；
M199培养基、胎牛血清及Ⅱ型胶原酶均购自美国Gibico 公司；
CO2恒温培养箱购自美国Thermo公司

3.实验步骤

A. 翅下静脉注射2mL EDTA-2Na（W/V，2%）溶液处死母鸡，新洁尔灭消毒液浸泡消毒5min，打开腹腔，剪取整个卵巢，小心剥离卵泡（以8-15g为最佳），置于装有PBS缓冲液的无菌培养皿中；
B. 用加有双抗的PBS缓冲液冲去血污，漂洗3次；将漂洗干净的卵泡移入装有预冷PBS缓冲液的平皿中，剥净卵泡外膜、结缔组织及血管网；
C. 用手术刀在卵泡表面划一道1-2cm长的切口（动作要快），释放卵黄，用PBS缓冲液将剩余的卵黄液漂洗干净，剩下的卵泡膜即为：基膜和卵泡颗粒细胞层；
D. 将漂洗干净的卵泡膜尽量剪碎，置于15mL离心管中，加4mL培养基，用1mL移液枪反复吹打1min，自然沉降5min，收集上清液备用；
E. 向离心管内加入4mL 0.2%Ⅱ型胶原酶，重悬沉淀，置于37℃恒温水浴锅中消化30min，每5min震荡一次；
F. 消化结束，加入4mL M199完全培养基（含10%血清）终止消化；用200目不锈钢筛过滤，收集滤液，1200rpm离心5min；
G. 沉淀用M199洗2次，室温离心，1200rpm，5min；弃上清，加入M199完全培养基（含5%FBS及1%双抗）重悬后接种于6孔塑料培养皿，置于37℃、5%CO2培养箱内静置培养；12-24h首次换液，随后每天观察，2-3天换液一次，待细胞生长融合用于实验。

Fig 1.卵泡构造模式图