原理
将 4~8 只新生鼠的小脑切成小立方块，放入 HBSS，在 37°C 条件下用胰蛋白酶消化 15 min。将细胞接种于涂有 L-多聚赖氨酸的培养皿或培养瓶。
材料与仪器
DMEM HBSS L-多聚赖氨酸 阿糖胞苷 0.025% 胰蛋白酶 硅酮
P e tr i培养皿 解剖刀 解剖剪 解剖镊 Pasteur吸管 10ml吸管 试管 水浴箱
P e tr i培养皿 解剖刀 解剖剪 解剖镊 Pasteur吸管 10ml吸管 试管 水浴箱
步骤
1. 在无菌条件下切除小脑，放入 HBSS（含有 3 g/L BSA）。
2. 用解剖刀将脑组织切成约 0.5 mm3 大小的立方体。
3. 将组织块移入 12 ml 试管，用 HBSS 洗 3 次。每次洗涤后让组织块沉到试管底部。
4. 加入 10 ml 用 HBSS 配制的 0.025 % 胰蛋白酶（用 HBSS 配制），在 37°C 条件下用水浴箱孵育 15 min。
5. 将胰蛋白酶消化的脑组织移入 50 ml 离心管，然后加入 20 ml 生长培养液，以终止胰蛋白酶的消化作用。
6. 通过用硅化的 Pasteur 吸管研磨使组织分散，直至获得单细胞悬液。
硅化 Pasteur 吸管：
(a)用超纯水将硅酮液稀释为 0.1%~1%；
(b)将吸管浸人硅酮液或用硅酮液冲洗吸管内面；
(c)放置 24 h 晾干或在 100°C 条件下放置几分钟使吸管变干；
(d)将吸管干热灭菌。
用 L-多聚赖氨酸处理培养皿：
(a)用超纯水溶解 L-多聚赖氨酸（10 mg/L）；
(b)将混合物过滤除菌；
(c)每个 35 mm Petri 培养皿内加入 1 ml L-多聚赖氨酸液；
(d)10~15 min 后吸出 L-多聚赖氨酸液，加入 1~15 ml 培养液；
(e)将培养皿在培养箱内放置 2 h 以上，至细胞接种。
7. 将盛有细胞悬液的离心管放 3~5 min，让小的组织团块沉到试管底。然后，用 Pasteur 吸管吸出组织团块。
8. 将单细胞悬液离心（200 g ，5 min ) 后，吸出上清液。
9. 用生长培养液混悬细胞团，然后接种细胞，每个培养皿的细胞密度为 2.5×106~3.0×106 个。
10. 培养 2~4 d 后（两天后最佳），加入 5~10 μmol/L 阿糖胞苷，继续培养 24 h。
11. 用 DMEM （含有 30 mmol/L 葡萄糖、2 mmol/L 谷氨酰胺、24.5 mmol/L 氯化钾、100 mU/L 胰岛素（Sigma，Ⅰ-1882）、7 μmol/L 对氨基苯甲酸（Sigma，A -3659）、100 μg/ml 庆大霉素和 10 % 加热灭活的 FCS）换液。
2. 用解剖刀将脑组织切成约 0.5 mm3 大小的立方体。
3. 将组织块移入 12 ml 试管，用 HBSS 洗 3 次。每次洗涤后让组织块沉到试管底部。
4. 加入 10 ml 用 HBSS 配制的 0.025 % 胰蛋白酶（用 HBSS 配制），在 37°C 条件下用水浴箱孵育 15 min。
5. 将胰蛋白酶消化的脑组织移入 50 ml 离心管，然后加入 20 ml 生长培养液，以终止胰蛋白酶的消化作用。
6. 通过用硅化的 Pasteur 吸管研磨使组织分散，直至获得单细胞悬液。
硅化 Pasteur 吸管：
(a)用超纯水将硅酮液稀释为 0.1%~1%；
(b)将吸管浸人硅酮液或用硅酮液冲洗吸管内面；
(c)放置 24 h 晾干或在 100°C 条件下放置几分钟使吸管变干；
(d)将吸管干热灭菌。
用 L-多聚赖氨酸处理培养皿：
(a)用超纯水溶解 L-多聚赖氨酸（10 mg/L）；
(b)将混合物过滤除菌；
(c)每个 35 mm Petri 培养皿内加入 1 ml L-多聚赖氨酸液；
(d)10~15 min 后吸出 L-多聚赖氨酸液，加入 1~15 ml 培养液；
(e)将培养皿在培养箱内放置 2 h 以上，至细胞接种。
7. 将盛有细胞悬液的离心管放 3~5 min，让小的组织团块沉到试管底。然后，用 Pasteur 吸管吸出组织团块。
8. 将单细胞悬液离心（200 g ，5 min ) 后，吸出上清液。
9. 用生长培养液混悬细胞团，然后接种细胞，每个培养皿的细胞密度为 2.5×106~3.0×106 个。
10. 培养 2~4 d 后（两天后最佳），加入 5~10 μmol/L 阿糖胞苷，继续培养 24 h。
11. 用 DMEM （含有 30 mmol/L 葡萄糖、2 mmol/L 谷氨酰胺、24.5 mmol/L 氯化钾、100 mU/L 胰岛素（Sigma，Ⅰ-1882）、7 μmol/L 对氨基苯甲酸（Sigma，A -3659）、100 μg/ml 庆大霉素和 10 % 加热灭活的 FCS）换液。
来源：丁香实验
