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免疫共沉淀(co-IP)实验案例分享

上海晶莱

21113

—— co-IP 检测 Hsp90 与 Cdc37 结合情况

1、实验材料

SKBR3 细胞,PMSF(Amresco,cat:329-98-6),cocktail(上海晶莱生物),脱脂奶粉(cat:66196131T),β-actin(上海晶莱生物)。Anti-Hsp90(santa,cat:sc-69703)、Anti-Cdc37(santa,cat:sc-13129)、Protein A+G agrose(Beyotime),细胞刮,4 度离心机(eppendorf,centrifuge 5415R),摇床(ORBITAL SHAKER,TS-1000),电泳仪(Tanon EPS300)。低速离心机(cat:TDZ4B-WS)。

2、实验方法

制样:

细胞裂解液配制:基础裂解液中加入 PMSF,cocktail 和 DTT

  • 实验分组:Control 组 、化合物 11(10μM)、化合物 11(20μM)、化合物 11(40μM),给药时间 24 h。

  • 弃培养上清,PBS 洗一遍,冰上加入 150ul/孔裂解液。

  • 于冰上裂解 30 min,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

  • 裂解完后,于 4℃ 下 12000rpm 离心 15 min。

  • 收集蛋白上清,取少许裂解液用于后续检测各蛋白表达情况。

  • 剩余的裂解液加入 Anti-Cdc37,4℃ 缓慢摇晃孵育过夜。

  • 用适量裂解缓冲液预处理 ProteinA+G,20uL/管加入各抗体孵育过夜的细胞裂解液中,4℃ 缓慢摇晃孵育 2~4 h。

  • 免疫沉淀反应后,4℃,3000rpm,3 min,小心吸取上清,琼脂糖珠用 1 mL 裂解液冲洗 3-4 次,最后加入 15uL undefinedSDS 上样缓冲液,100℃,5 min。

  • Laemmli-SDS-PAGE

电泳:

电泳时根据情况每块胶 15mA 恒流电源;根据预染 Marker 和目的蛋白的分子量大小的相对位置判断最佳跑胶时间,以使目的蛋白处于分离胶面的下 1/3 的最佳分辩位置。

转膜:

  • 将 PVDF 膜放到甲醇中浸泡 2 min

  • 将转膜夹打开,在代表负极的黑色面铺上一块湿润的海绵垫,再添加 2 层湿润的滤纸,将 SDS-PAGE 胶小心地铺在滤纸上,表面再覆盖大小合适的 PVDF 膜;然后再覆盖两层湿润滤纸,再垫上湿润的海绵垫,将红色的正极板合上,夹好,插入转膜槽相应的位置。

  • 转膜过程在 4℃ 进行,采用 100V/100mA。

  • 丽春红染色:转膜过程完成后,将膜从转膜夹中取出,立即投入丽春红染液中染色,大约染色 5 分钟后将膜由丽春红中取出,用清水轻轻冲洗膜,注意观察膜上的红色条带,当条带足够清晰后停止水洗,根据染色条带把膜适当剪小,留出目的蛋白所在的范围。然后用清水彻底冲洗膜,尽可能洗去残留的丽春红,使得条带消失。

封闭:

一般抗体采用 5% 脱脂奶粉+TBST 封闭;封闭时间为室温下一个小时,在摇床上进行。

一抗杂交:

在一个 1.5 ml 的 EP 管中加入 1 ml 的封闭液(5% 脱脂奶粉+TBST),再加入适量的一抗,置于 4℃ 冰箱中过夜。

洗膜:

将过夜杂交的膜从塑料袋中取出,投入含有足量体积 TBST 的洗膜盒中,于摇床上清洗,每次 10 分钟,连续 3 次。

二抗杂交:

处理步骤类似一抗杂交步骤,不同之处在于二抗杂交可在常温下,1 小时内完成。二抗比例控制在 1:2000~1:5000。

洗膜:

见步骤 7。

显影:

将膜平放于干燥的平面上,将新鲜配置好的 ECL Reagent 滴加到有铅笔记号标注的膜面上,反应 5 分钟后用滤纸在膜的边缘尽量吸去多余的 ECL Reagent,将膜放到化学发光仪中收集信号。

3、实验结果:

IP:Hsp90,IB:Cdc37

IP:Hsp90,IB:Cdc37--黑白

IP:Hsp90,IB:Hsp90

IP:Hsp90,IB:Hsp90--黑白

晶莱生物是一家致力于生命科学和生物技术领域的高科技企业。专门从事生物实验外包服务与抗体、试剂盒、生物研究原材料等为主的生命科学产品销售与研发,涵盖了动物实验、细胞生物学、分子生物学、免疫学等研究领域。欢迎咨询详谈,我们会根据您的方案及需求制定详细的服务协议。

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