蛋白质抽取

蛋白质在细菌中表现后，以反复的冷冻-解冻方法打破细胞，再用硫酸铵把蛋白质沉淀下来，此步骤可以去除大部份核酸、多醣、脂质等杂物。

仪器用具：恒温震荡培养箱37℃；高速冷冻离心机及离心管 （使用20,000 rpm离心陀）使用高速离心机要注意： 离心机及离心陀的温度要预冷完全，相对位置的两只离心管要平衡好，离心陀转速绝对不能超过最高速限；液态氮及冰筒；37℃温水浴

药品试剂：转型菌株pQG11/M15 [pREP] 单一菌落；LB/amp/kan 及IPTG （1 M stock）；Lysis buffer （50 mM Na3PO4·12H2O, pH 7.0; 0.1 M NaCl; 0.1 mM EDTA; 0.2%Triton X-100）

使用前添加成10 mM β-mercaptoethanol, 25 μg/mL PMSF, 40 μg/mL lysozyme.Buffer A-0 （50 mM Na3PO4, pH 7.0） 使用前每1 L 添加70 μL β-mercaptoethanol 成为10 mM 最终浓度。Buffer A-150: Buffer A-0 再加有0.15 M NaCl;硫酸铵 （要烘干并以研砵磨碎）

方法步骤：

1） 挑取培养皿上单一菌落，培养在15 mL 的LB/amp/kan 液体培养基中，以120rpm 转速震荡，在37℃下培养过夜。

2） 取上述菌液6 mL加入300 mL新鲜LB/amp/kan培养基中，以120 rpm 37℃培养至A600 = 0.6 后，加入IPTG成为1 mM浓度，继续以120 rpm在37℃震荡培养4 h.

3） 将菌液倒入50 mL 离心管 （conical tube） 中离心10 min （5,000 rpm）。

4） 倒去上清，可将菌块连同离心管置 -20℃冰箱贮存。

5） 取出含菌块的离心管置碎冰上，待菌块溶解后，以残存液体均匀悬浊的。再

加入10 mL lysis buffer 轻轻悬浮的。

6） 将菌液放在液态氮中冷冻1 min,然后在37℃水浴中摇荡溶解的。如此反复三次，尽量不要产生大量气泡。将离心管的内容物倒入50 mL 高速离心机的离心管内。

7） 离心20 min （12,000 rpm, 4℃） 取上清共 _____ mL,称为 粗抽取液 （XT）；预留100 μL 以便日后一起进行分析。此后样本均得放置碎冰上，以低温进行实验。

8） 此上清加入5 mL buffer A-0 混匀后倒入烧杯，置碎冰上放冷，不时搅拌并缓缓加入固体硫酸铵 _____ gm,使成为70%饱和度，加完后再搅拌10 min.

9） 离心20 min （12,000 rpm, 4℃） 后小心倒去上清，取白色沉淀部份。

10） 沉淀加以2 mL buffer A-150 均匀悬浊的，再以桌上型离心机去除不溶物质，（10,000 rpm,5 min），共得 ______ mL,称为 全蛋白质 （TP）；预留100 μL,连同上述XT 置4℃冷藏。

11） 其余溶液部份准备进行胶体过滤层析，标示清楚后置4℃冷藏。