大肠杆菌抽取RNA

之前已分别构筑出GUS 基因的表现质体pQG11,若要令启动子T5promotor 的启动受到更好的调控，应进一步将pQG11 转形至大肠杆菌M15[pREP4]. M15[pREP4] 可持续表现lac repressor,pQG11 上用以驱动GUS基因表现的T5 promoter 的活性将因而受到抑制，但一旦加入IPTG 就能诱导GUS基因大量表现。

在这一节的实验里，我们将分别自经IPTG 诱导与未经诱导的pQG11/M15[pREP4] 菌体抽取total RNA,以便以北方杂合反应分析GUS mRNA的表现情形。 下面所采用的方法适用于大肠杆菌及其他革兰氏阴性菌total RNA的抽取，实验进行时先以lysozyme 分解细胞壁，再以sodium dodecyl sulfate （SDS）裂解原生质膜 （Summers, 1970; Ausubel et al., 2005）；的后加入适量的氯化钠溶液将SDS、蛋白质及大肠杆菌的染色体DNA 一并沉淀下来，并以离心法移除，存留于上清液的RNA 则以酒精沉淀。 实验过程所使用的RNase 抑制剂为DEPC.

仪器用具：恒温震荡培养箱37℃；冰浴；微量离心机；分光光度计 （Hitachi U-1100 spectrophotometer）

药品试剂：大肠杆菌菌株pQG11/M15[pREP4];LB 培养液；Ampicillin （100 mg/mL）；Kanamycin （25 mg/mL）；IPTG （1 M）；Protoplasting buffer （15 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.45 M sucrose; 8 mM EDTA, stored at 4℃）；Lysozyme （50 mg/mL）；Gram-negative lysing buffer （10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 10 mM NaCl； 1 mM sodium citrate; 1.5% SDS）；Diethylpyrocarbonate （DEPC）；饱和氯化钠溶液 （以40 g氯化钠溶解于100 mL dH2O/DEPC）；绝对酒精及70%酒精

方法步骤：

大肠杆菌pQG11/M15[pREP4] 的培养：

1） 将pQG11/M15[pREP4] 接种于2 mL含ampicillin （100 μg/mL） 及kanamycin（25 μg/mL） 的LB培养液，于37℃震荡培养过夜。

2） 隔日早晨，取0.5 mL pQG11/M15[pREP4] 过夜培养液，加入25 mL 含有ampicillin （100 μg/mL） 与kanamycin （25 μg/mL） 的LB 培养液，于37℃震荡培养2 h。

3） 加入25 μL 1 M IPTG，继续放置于37℃震荡培养。

4） 经过4 h 后，取出pQG11/M15[pREP4] 培养液，开始进行RNA 制备工作。

制备RNA：注意！进行以下RNA 制备实验时，除了使用依上述步骤所准备的pQG11/M15[pREP4] 培养液外，请记得向助教领取未经IPTG 诱导的pQG11/M15[pREP4] 培养液当做对照组。

1） 取出4 支1.5 mL 微量离心管，分别标示为I-1, I-2, U-1 与U-2。

2） 取3 mL 经IPTG 诱导的pQG11/M15[pREP4] 培养液平均分置于微量离心管I-1 与I-2。

3） 取3 mL 未经IPTG 诱导的pQG11/M15[pREP4] 培养液平均分置于微量离心管U-1 与U-2。