大肠杆菌抽取RNA

之前已分别构筑出GUS 基因的表现质体pQG11,若要令启动子T5promotor 的启动受到更好的调控，应进一步将pQG11 转形至大肠杆菌M15[pREP4]. M15[pREP4] 可持续表现lac repressor,pQG11 上用以驱动GUS基因表现的T5 promoter 的活性将因而受到抑制，但一旦加入IPTG 就能诱导GUS基因大量表现。

在这一节的实验里，我们将分别自经IPTG 诱导与未经诱导的pQG11/M15[pREP4] 菌体抽取total RNA,以便以北方杂合反应分析GUS mRNA的表现情形。 下面所采用的方法适用于大肠杆菌及其他革兰氏阴性菌total RNA的抽取，实验进行时先以lysozyme 分解细胞壁，再以sodium dodecyl sulfate （SDS）裂解原生质膜 （Summers, 1970; Ausubel et al., 2005）；的后加入适量的氯化钠溶液将SDS、蛋白质及大肠杆菌的染色体DNA 一并沉淀下来，并以离心法移除，存留于上清液的RNA 则以酒精沉淀。 实验过程所使用的RNase 抑制剂为DEPC.

仪器用具：恒温震荡培养箱37℃；冰浴；微量离心机；分光光度计 （Hitachi U-1100 spectrophotometer）

药品试剂：大肠杆菌菌株pQG11/M15[pREP4];LB 培养液；Ampicillin （100 mg/mL）；Kanamycin （25 mg/mL）；IPTG （1 M）；Protoplasting buffer （15 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.45 M sucrose; 8 mM EDTA, stored at 4℃）；Lysozyme （50 mg/mL）；Gram-negative lysing buffer （10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 10 mM NaCl； 1 mM sodium citrate; 1.5% SDS）；Diethylpyrocarbonate （DEPC）；饱和氯化钠溶液 （以40 g氯化钠溶解于100 mL dH2O/DEPC）；绝对酒精及70%酒精

方法步骤：

大肠杆菌pQG11/M15[pREP4] 的培养：

1） 将pQG11/M15[pREP4] 接种于2 mL含ampicillin （100 μg/mL） 及kanamycin（25 μg/mL） 的LB培养液，于37℃震荡培养过夜。

2） 隔日早晨，取0.5 mL pQG11/M15[pREP4] 过夜培养液，加入25 mL 含有ampicillin （100 μg/mL） 与kanamycin （25 μg/mL） 的LB 培养液，于37℃震荡培养2 h。

3） 加入25 μL 1 M IPTG，继续放置于37℃震荡培养。

4） 经过4 h 后，取出pQG11/M15[pREP4] 培养液，开始进行RNA 制备工作。

制备RNA：注意！进行以下RNA 制备实验时，除了使用依上述步骤所准备的pQG11/M15[pREP4] 培养液外，请记得向助教领取未经IPTG 诱导的pQG11/M15[pREP4] 培养液当做对照组。

1） 取出4 支1.5 mL 微量离心管，分别标示为I-1, I-2, U-1 与U-2。

2） 取3 mL 经IPTG 诱导的pQG11/M15[pREP4] 培养液平均分置于微量离心管I-1 与I-2。

3） 取3 mL 未经IPTG 诱导的pQG11/M15[pREP4] 培养液平均分置于微量离心管U-1 与U-2。

4） 以8,000 rpm （4℃） 离心5 min，小心倒掉上清液，并以微量移液器尽量吸掉残留的液体。

5） 各加入0.5 mL protoplasting buffer，以微量移液器将大肠杆菌充分悬浮。

6） 再加入1 mL protoplasting buffer 与12 μL 50 mg/mL lysozyme,混合均匀的后，移置于冰浴中作用15 min.

7） 以7,000 rpm 于4℃离心5 min.

8） 小心倒出上清液，并以微量移液器尽量吸掉残留的液体。

9） 各加入75 μL gram-negative lysing buffer 及2 μL DEPC,以微量移液器小心悬浮沉淀于管底的大肠杆菌原生质体，并离心数秒。 在以微量移液器悬浮大肠菌原生质体时，一旦pellet 被充分打散即应停止悬浮动作，以避免大肠菌DNA 断裂可能造成的问题。 DEPC 可能是一种致癌物质，使用时请在抽气橱内操作。

10） 将微量离心管放入37℃恒温水槽作用5 min.

11） 作用完毕的后，将离心管移到冰浴中静置5 min.

12） 加入38 μL 饱和氯化钠溶液，以手指头轻弹管壁，充分混合均匀。

13） 静置于冰浴中作用10 min,此时应有白色沉淀出现。

14） 以13,000 rpm 于4℃离心10 min.

15） 将上清液移至新的微量离心管，并加入0.3 mL 绝对酒精。

16） 混合均匀后将离心管放置于 -20℃过夜，以便沉淀RNA. RNA 在酒精内相当稳定，若须长期保存，可停在这一步。

17） 以14,000 rpm 于4℃离心15 min.

18） 小心倒掉上清液后，加入300 μL 70%酒精。

19） 以14,000 rpm 于4℃离心5 min 的后，小心倒掉上清液。

20） 将微量离心管倒置于桌面上30 min，以便风干RNA.

21） 将RNA溶解于30 μL dH₂O/DEPC。

22） RNA定量：取5 μL RNA，加入995 μL dH2O/DEPC稀释的后，以分光光度计测其在260 nm与280 nm的吸光值 （记得使用石英测光管），并计算RNA的浓度与A260/A280的比值。 RNA溶液在260 nm的吸光值为1.0 时，则浓度相当于40 μg/mL，而其A260/A280的比值应为1.7~2.0 （DNA则为1.8 左右）。 这四个RNA 样本将于后续实验中，分别以甲醛洋菜胶体电泳进行分析