细菌蛋白质抽取的方法步骤

1.仪器用具：

（1）恒温震荡培养箱37℃；

（2）高速冷冻离心机及离心管（使用20,000 rpm离心陀）；

（3）液态氮及冰筒；

（4）37℃水浴锅

使用高速离心机要注意： 离心机及离心陀的温度要预冷完全，相对位置的两只离心管要平衡好，离心陀转速绝对不能超过最高速限；

2.药品试剂：

（1）转型菌株pQG11/M15 [pREP] 单一菌落；

（2）LB/amp/kan 及IPTG （1 M stock）；

（3）Lysis buffer （50 mM Na₃PO4·12H₂O, pH 7.0; 0.1 M NaCl; 0.1 mM EDTA; 0.2%Triton X-100）。使用前添加成：10 mM β-mercaptoethanol, 25 μg/mL PMSF, 40 μg/mL lysozyme；

（4）Buffer A（50 mM Na₃PO₄, pH 7.0） 使用前每1 L 添加70 μL β-mercaptoethanol 成为10 mM 最终浓度；

（5）Buffer B： Buffer A 再加入0.15 M NaCl；

（6）硫酸铵 （要烘干并以研砵磨碎）。

3.方法步骤：

（1） 挑取培养皿上单一菌落，培养在15 mL 的LB/amp/kan 液体培养基中，以120rpm 转速震荡，在37℃下培养过夜。

（2） 取上述菌液6 mL加入300 mL新鲜LB/amp/kan培养基中，以120 rpm 37℃培养至A₆₀₀ = 0.6 后，加入IPTG成为1 mM浓度，继续以120 rpm在37℃震荡培养4 h。

（3） 将菌液倒入50 mL 离心管（conical tube）中离心10 min （5,000 rpm）。

（4） 倒去上清，可将菌块连同离心管置 -20℃冰箱贮存。

（5） 取出含菌块的离心管置碎冰上，待菌块溶解后，以残存液体均匀悬浊的。再加入10 mL lysis buffer 轻轻悬浮的。

（6） 将菌液放在液态氮中冷冻1 min，然后在37℃水浴中摇荡溶解的。如此反复三次，尽量不要产生大量气泡。将离心管的内容物倒入50 mL 高速离心机的离心管内。

（7） 离心20 min （12,000 rpm, 4℃） 取上清共 _____ mL,称为 粗抽取液 （XT）；预留100 μL 以便日后一起进行分析。此后样本均得放置碎冰上，以低温进行实验。

（8） 此上清加入5 mL buffer A 混匀后倒入烧杯，置碎冰上放冷，不时搅拌并缓缓加入固体硫酸铵 _____ gm，使成为70%饱和度，加完后再搅拌10 min。

（9） 离心20 min（12,000 rpm, 4℃）后小心倒去上清，取白色沉淀部份。

（10） 沉淀加以2 mL buffer B均匀悬浊的，再以桌上型离心机去除不溶物质，（10,000 rpm,5 min），共得 ______ mL，称为 全蛋白质（TP）；预留100 μL，连同上述XT 置4℃冷藏。

（11） 其余溶液部份准备进行胶体过滤层析，标示清楚后置4℃冷藏。