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用CaCl2处理制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞

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1. 从37℃培养16~20 h 的新鲜平板中挑取一个单菌落(如大肠杆菌DH52),或1 ml 新鲜的16~20 h过夜培养物,转到一个含有100ml LB培养基的1 L 或500 ml 培养瓶中。于37℃振摇培养约2~3 h(旋转摇床200~300 r/min),每隔20~30 min测量OD600值≈0.4。

2. 在无菌条件下将细菌转移到一个,用冰预冷的50 ml 聚丙烯离心管中,冰上放置10~20 min。

3. 于4℃4000转 /分离心10 min,回收细菌细胞。

4. 将管倒置1 min,以使最后残留的痕量培养液流尽。

5. 以10 ml 用冰预冷的0.1 mM CaCl2重悬每份沉淀,放于冰上 , 4℃4000转 /分离心10 min,回收细菌细胞。

6. 每50 ml 初始培养物用2 ml 冰预冷的0.1 M CaCl2重悬每份沉定,此时,可以迅速将细胞分装成小份,液氮中冰冻,-70℃贮存备用。

7. 用无菌吸头从感受态细胞悬液中取200 μl 转移到无菌的微量离心管中,加DNA或连接反应混合物(体积≤10 μl,DNA≤50 ng),轻旋以混匀内容物,冰浴30 min。

8. 将离心管放到预加温到42℃的水浴中,90 s。

9. 将混合物快速转移到冰浴中,冷却1~2分钟,加入适当的培养基在37 ℃培养45 分钟,使细胞复苏,并表达质粒所携带的转化基因。

10. 将适当体积(每个90 mm平板可达200 μl)已转化的感受态细胞转移到相应抗生素的平板培养基上。

11. 将平板置于室温至液体被吸收 ,倒置平板于37℃培养箱中,12~16 h,平板培养,克隆在此期间应该出现,否则转化不成功。

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