用CaCl2处理制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞

1 从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落(如 大肠杆菌 DH52),或1ml新鲜的16～20h过夜培养物,转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml 培养瓶中.1mMCaCl2重悬每份沉淀,放于冰上 ,4℃4000转 /分离心10min,回收 细菌 细胞.1M CaCl2重悬每份沉定,此时,可以迅速将细胞分装成小份,液氮中冰冻,-70℃贮存备用.

2. 从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落(如大肠杆菌DH52),或1ml新鲜的16～20h过夜培养物,转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml培养瓶中.于37℃振摇培养约2～3h(旋转摇床200～300r/min),每隔20～30min测量OD600值≈0.4.

3．在无菌条件下将细菌转移到一个,用冰预冷的50ml聚丙烯 离心管 中,冰上放置10～20min；

4. 于4℃4000转 /分离心10min,回收细菌细胞；

5. 将管倒置1min,以使最后残留的痕量培养液流尽；

6. 以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀,放于冰上 ,4℃4000转 /分离心10min,回收细菌细胞；

7. 每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉定,此时,可以迅速将细胞分装成小份,液氮中冰冻,-70℃贮存备用.

8. 用无菌吸头从 感受态细胞 悬液中取200μl转移到无菌的微量离心管中,加 DNA 或连接反应混合物(体积≤10μl,DNA≤50ng),轻旋以混匀内容物,冰浴30min；

9. 将离心管放到预加温到42℃的水浴中,90s；

10. 将混合物快速转移到冰浴中,冷却1-2分钟,加入适当的培养基在37 ℃培养45 分钟,使细胞复苏,并表达质粒所携带的转化基因；

11. 将适当体积(每个90mm平板可达200μl)已转化的感受态细胞转移到相应 抗生素 的平板培养基上.

12. 将平板置于室温至液体被吸收 ,倒置平板于37℃ 培养箱 中,12～16h,平板培养,克隆在此期间应该出现,否则转化不成功.