逆转录PCR的原理及操作注意事项

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逆转录PCR （ RT-PCR ）的原理

逆转录PCR (RT-PCR )具有较高的灵敏性、操作简单等优点，常用于基因定量分析、生物学检测等，此外常用逆转录PCR克隆目的基因。 本文主要讲述了逆转录PCR的原理、重要参数以及操作注意事项。

cDNA的合成是RT-PCR 的重要环节。以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下，随机引物、oligo(dT)或基因特异性引物的引导下合成互补的DNA(complementary DNA，cDNA)，再按照普通PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，则可扩增出不含内含子的可编码完整基因的序列。

逆转录PCR 重要参数

不同mRNA拷贝成cDNA的效率不同;因此，适合于一种mRNA拷贝的条件可能对另一种mRNA不适合。一般来说，从事不均一mRMA群体时，所使用的条件是导致cDNA合成的终产量达到最大，下述参数十分重要。

1.逆转录酶 有两种不同的逆转录酶可以催化以mRNA为模板，oligo(dT)作为引物，合成与mRNA互补的cDNA链。一种来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒(AMV)，由两条肽链组成，具有聚合酶活性和很强的RNA酶H活性，它最适温度是42℃，最适pH8.3。在高反应温度时可消除mRNA的二级结构对逆转录的阻碍，然而高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA产生也限制其长度。另外，禽源逆转录酶制剂可被能切割DNA的核酸内切酶污染。

另一种来源于鼠白血病病毒(Mo-MLV)，是单肽链的，有RNA聚合酶活性和相对较弱的RNA酶H活性，最适温度37℃，最适pH7.6，较弱的RNA酶H活性对获得2-3kb的mRNA的全长cDNA有很大好处。

在第一链反应前可用氢氧化甲基汞处理，破坏mRNA的二级结构，这一步对于最适反应温度较低(37)℃的鼠源逆转录酶催化的反应可能更为重要。临合成cDNA第一链之前加入过量的巯基试剂，可以使氢氧化甲基汞从RNA上解离。

2.单价阳离子 离子条件基本上影响各种模板的转录效率。用钾比用钠离子可获得较长的转录产物。对于cDNA长度的最适钾离子浓度为140-150mM。

3.二价阳离子 对于反转录酶活性来说，二价阳离子是必需的。低于4mM Mg2 未能观察到活性;产生全长转录产物的最适浓度是6-10mM。

4.脱氧核苷三磷酸 使用四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)中每一种的高浓度对于有效合成cDNA是特别重要的。如果其中只有一种的浓度下降到10-50微摩尔以下，全长转录物的产量将明显下降。常用的dNTP的浓度为200-250微摩尔。

材料与方法

1 材料

RNA样品

2 仪器、用具

PCR仪、电泳仪等、0.2mlPCR管(1个)、移液器、碎冰

3 试剂

RNase Free dH2O;5×RT Buffer (含25mM Mg2 );dNTP (10mM each);RNase Inhibitor(10U/μl );Oligo (dT)20 (10μmol/L);ReverTra Ace

4 方法

(1) 以总RNA为模板，合成cDNA第一链，体系如下：

(2) 反转录反应条件为：30℃ 10min，42℃ 30min ，99℃ 5min，4℃ 5min。反应结束后冰

浴5min。

注意事项：

① cDNA第一链合成的反应液冰上配制。

使用ReverTra Ace、RNase Inhibitor 等酶类时，应轻轻混匀，避免起泡;由于酶保存液

中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。

逆转录PCR时，提取RNA是关键，收集RNA沉淀时，离心速度不要低于13000rpm，在离心前的沉淀也尽可能在低温下条件下操作，此外逆转录酶可以选择MMLV逆转录酶，主要是因为这个条件比较容易掌握