四 逆转录PCR (RT-PCR)
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实验 逆转录PCR (RT-PCR) |
【实验目的】 |
1.了解用逆转录PCR法获取目的基因的原理。 |
【实验原理】 |
聚合酶链式反应(PCR)过程利用模板变性,引物退火和引物延伸的多个循环来扩增DNA序列。因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板,是一个指数增长的过程,使其成为检测核酸和克隆基因的一种非常灵敏的技术。一般经25-35轮循环就可使模板DNA扩增达106 倍。RT-PCR将以RNA为模板的cDNA(complement DNA)合成(即RNA的反转录(RT,reversetranscription)),同cDNA的PCR结合在一起的技术,提供了一种基因表达检测、定量和cDNA克隆的快速灵敏的方法。由于cDNA包括了编码蛋白的完整序列而且不含内含子,只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究,因此RT-PCR成为目前获得目的基因的一种重要手段。
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术,更灵敏,更易于操作。
RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。两步法RT-PCR比较常见,在使用一个样品检测或克隆多个基因的mRNA时比较有用。在两步法RT-PCR中,每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行,然后取出1/10的反应产物进行PCR。而一步法RT-PCR具有其它优点(表4.2),cDNA合成和扩增反应在同一管中进行,不需要打开管盖和转移,有助于减少污染。还可以得到更高的灵敏度,最低可以达到0.1pg总RNA,因为整个cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法RT-PCR,一般使用基因特异性引物(GSP)起始cDNA的合成。
已经制备好的双链cDNA和一般DNA一样,可以插入到质粒或噬菌体中,为此,首先必需有适当的接头(Linker),接头可以是在PCR引物上增加限制性内切酶识别位点片段,经PCR扩增后再克隆入相应的载体;也可以利用末端转移酶在载体和双链cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重组质粒,并转化到宿主菌中进行扩增。 |