运用Cell Based Elisa检测信号通路蛋白和磷酸化蛋白

研究信号通路时，特别是对于高通量样本检测，通过传统的WB方法来检测蛋白是一项非常费时费力的工作。

为了解决这个问题，科学家开始尝试一种新的方法，希望更加高效，简单，没有任何辐射的来检测这些蛋白，尤其是信号传导研究中的磷酸化蛋白。

Cell Based Elisa 提供了这样一种理想的，高效的，直接的检测大量样本的细胞信号通路蛋白的方法。

我们通过了解Cell Based Elisa 的实验步骤来解析怎样检测高通量的样本中的蛋白，尤其是信号通路相关的蛋白。

原理图


1. 在Cell Based Elisa中细胞被研究者种到了我们的96孔板中，按照研究者的预设实验方案，细胞被刺激。

2. 当需要检测样本中的蛋白的时候，传统的WB方法需要研究者将细胞裂解，蛋白质提取，并且运用电泳的方法在胶上将蛋白跑开，并且将他们很好的转到膜上面，再进行膜的封闭等操作。所有前期的工作是为了将蛋白准备好以待后期的抗体孵育及进一步检测。

目前研制的不用裂解蛋白并且跑电泳转膜就能检测蛋白的Cell Based Elisa盒子虽然仅有一两千种，但是已经解决了常用的蛋白的高通量检测。这些盒子包括Immunoway公司的产品，R&D公司也有类似产品。

在我们这里先介绍两种目的蛋白的检测实验

we presented data on two targets: p38 mitogen activated protein kinase (MAPK) and stress-activated protein kinase/Jun-terminal kinase (SAPK/JNK)

其中P38 MAPK和JNK是参与到separate MAP kinase cascade pathways and function mainly in stress response like inflammation and apoptosis

Figure 2: p38 detection with FACE



Cells were serum-starved for 16 hours and stimulated with 0, 0.1, 1 and 10 µg/ml anisomycin for 15 minutes (Lanes 1–4). A Western blot was performed with 8 mg of extracts using Phospho-p38 antibody (A) and Total-p38 antibody (B). Cell Based Elisa were performed directly in the 96-well plates using Phospho-p38 and Total-p38 antibodies (C).

Figure 3: JNK detection with FACE




Cells were serum-starved for 16 hours and stimulated with 0, 0.1, 1 and 10 µg/ml anisomycin for 15 minutes (Lanes 1–4). A Western blot was performed with 8 mg of extracts using Phospho-p38 antibody (A) and Total-p38 antibody (B). Cell Based Elisa assays were performed directly in the 96-well plates using Phospho-p38 and Total-p38 antibodies (C).

Cell-Based Elisa

将小鼠巨噬细胞4/4细胞种在96孔板内，每个孔种5 x 104 cells/cm2细胞。细胞用不同浓度的anisomycin刺激，我们来监测P38 MAPK和JNK两种蛋白的变化。按照试剂盒的实验步骤，分别固定，打孔，猝灭，封闭，然后一抗孵育，二抗孵育，最后显色，用常规的酶标仪读取数值。最后数据再和试剂盒提供的结晶紫核染料结果做纠正，最后得出以上数据。

Quantitative results of phosphorylated proteins

磷酸化的试剂盒中的抗体是经过大量筛选，选取了高特异性和低背景的抗体。p-P38MAPK抗体是基于P38的磷酸化Thr180到Tyr182这个位点多肽片段所制备。P-JNK抗体是基于人的Thr183和Tyr185.这个抗体可以同时识别P-JNK1和P-JNK2.

我们在运用Cell Based Elisa P38和JNK两个试剂盒做检测的同时，又用传统的WB方式来验证这个结果。经过反复验证，都得出了同样的结果，Cell Based Elisa 试剂盒和传统的WB实验结果完全吻合。

Summary

Cell Based Elisa 作为一种蛋白检测的新方法，不仅能特异性的，高效的检测蛋白的相对含量。尤其对很多信号通路，磷酸化蛋白的研究具有非常大的优势，在和传统的WB检测方法比较中，我们发现该方法还克服了磷酸化蛋白的降解这个一直困扰研究者的问题，所以在信号通路的研究中非常有优势。