基本方案 带分析

检测出目标蛋白是磷蛋白后，可将这个蛋白质的磷酸化过程在无细胞系统或天然细胞系统中进行研究。大多数蛋白激酶除了在细胞内还可在胞外进行许多底物的磷酸化。天然细胞的渗透化处理为得到满意结果提供了一个有效的实验方法，通过使用一些不同的试剂可以使细胞处于短暂的渗透状态。这个过程使反应发生在细胞内环境，而信号转导还能通过激素激活细胞表面受体而启动。

实验试剂及仪器具体要求见「其他」。

1. 贴壁细胞培养：

1.1 实验前约 1 h，将待标记细胞的培养液换为含有 20 mmol/L HEPES 的平衡培养液。重新放入培养箱，用新培养液平衡细胞。

1.2 将细胞培养皿置于 37℃ 水浴中 10 min, 再次平衡细胞。吸弃皿中培养液，用 10 ml 37℃ 预热的胞外缓冲液迅速冲洗细胞 2 次，吸尽胞外缓冲液，加 0.5~2 ml 的有渗透性的缓冲液于培养皿中。对有些贴壁性较差的细胞，在清洗时要多加小心。

1.3 加链球菌溶血素 O （60 U/ml 工作液）于每块培养皿中，终浓度 0.6 U/ml。按终浓度 100 mmol/L 加入预冷的 ATP 溶液（10 mmol/L 储存液）。

1.4 37℃，培养细胞 1~5 min。培养时间取决于研究系统和细胞类型，应根据经验确定。

1.5 加入 10 mCi/ml [γ-³²P] ATP, 使终浓度达到 50~500 μCi/ml。

1.6 按研究需要加入药理试剂、多肽或 Fab'片段等相关试剂，必要时加入受体激动剂，并按需求制订它们的作用时间。

1.7 贴壁细胞培养。迅速吸尽有渗透性的缓冲液，加入 0.75 ml 预冷 2 × 裂解缓冲液，以停止反应，准备进一步的免疫沉淀。加入蛋白酶抑制剂和 DTT （储存溶液），溶液各组分的终浓度为：

1 mmol/L PMSF

1 mmol/L 苯甲酸

5 μg/ml 抑肽素 A

5 μg/ml 亮抑蛋白酶肽

5 μg/ml 抗蛋白酶

1 mmol/L DTT

将培养板置于冰上，10 min，然后用细胞刮片从板底刮离细胞于缓冲液中。每板都必须更换新刮片。

1.8 转移裂解液到带旋盖的微量离心管中（每管一个培养皿或一份细胞）。4℃，最大速度离心，将上清转移至带螺旋盖的新离心管中，在干冰/乙醇浴中快速冷冻，储存于 -70℃，备用（免疫沉淀）。

2. 悬浮培养：

2.1 实验前约 1 h，转移细胞至 50 ml 无菌离心管中，1000 g，室温离心 5 min。弃上清，用 40 ml 37℃ 的胞外缓冲液冲洗细胞 2 次，1000 g，室温离心 5 min，弃上清。

如果需要，在加入最终的胞外培养液后，细胞悬液可按等份分开。如下操作：在最后加入 40 ml 胞外培养液后轻轻重悬细胞，并将细胞按等份分入新管中，离心，移出并弃去上清，在进行步骤 2.2 前完成清洗过程。

2.2 以 1 × 10⁷ 细胞/ml 的浓度将细胞重悬于 37℃ 的胞外缓冲液中，37℃ 下通过轻柔的涡旋平衡细胞 15~30 min，再次室温 1000 g 离心 5 min，吸尽缓冲液。

如果实验中使用较敏感的细胞（如血小板），这一步骤应被修正：平衡时间可减至 5~10 min，涡旋细胞的步骤也可省略。

2.3 按 0.6 U/ml 的终浓度将链球菌溶血素 O （60 U/ml 工作溶液）加入新配制的 37℃ 有渗透性的缓冲液，加入预冷 ATP 溶液（10 mmol/L 储存液），终浓度 100 μmol/L。

将含有链球菌溶血素 O 和 ATP 的有渗透性的缓冲液与细胞轻轻充分混匀。

2.4 37℃，培养细胞 1~5 min。

培养时间取决于研究系统和细胞类型，应根据经验确定。

2.5 加入 10 mCi/ml [γ-³²P] ATP, 使终浓度达到 50~500 μCi/ml。

2.6 按研究需要加入药理试剂、多肽或 Fab'片段等相关试剂，必要时加入受体激动剂，并按需求制订它们的作用时间。

2.7 悬浮培养。加入等体积冰浴的 2 × 裂解缓冲液，停止反应，准备进一步的免疫沉淀，加入蛋白酶抑制剂和 DTT，溶液中各组分的浓度与 1.7 中相同。放置细胞在冰上，10 min。

2.8 转移裂解液到带旋盖的微量离心管中（每管一个培养皿或一份细胞）。4℃，最大速度离心，将上清转移至带螺旋盖的新离心管中，在干冰/乙醇浴中快速冷冻，储存于 -70℃，备用（免疫沉淀）。

1. 再怎么强调也不为过的是每个研究者应当完全熟悉当地关于 ³²P 管理和处理规范，并具备处理 ³²P 污染的设备。

2. 此单元中所用水应为 Milli-Q 纯净水或纯净级别与之相当的水。

3. 通常购买的 [γ-³²P] ATP，活性约为 3000 Ci/mol，浓度约为 10 mCi/ml。5 μl 的储存液含有 50 μCi/ml 的 [γ-³²P] ATP, 此浓度正好可用于标记。若储存的 [γ-³²P] ATP 用其他溶液稀释，最好在使用前再稀释。

4. 在步骤 1.6 和 2.6 中，依据部分预试验的数据和经验制定特殊试剂的反应时间。[γ-³²P] ATP 与链球菌溶血素 O 和预冷ATP 在同一时间加入。

试剂：

适宜的细胞培养液。含 20 mmol/L HEPES 的缓冲液 pH 7.2，37℃

预热研究用细胞（传代细胞或被分离的原代细胞）

细胞外缓冲液，37℃

有渗透性的缓冲液，37℃

60 U/ml 链球菌溶血素 O 工作溶液，新鲜制备

10 mmol/L 预冷的 ATP 储存溶液

10 mCi/ml [γ-³²P] ATP （3000 Ci/mmol；DuPont NEN）

研究用的药理试剂，多肽或 Fab'片段

适宜的受体激动剂

2 × 免疫沉淀用裂解缓冲液，冰浴。

蛋白抑制剂储存溶液（储存在无水乙醇中，-20℃ 可储存 6 个月以上）：

100 mmol/L 苯甲基磺酰氟（PMSF）

100 mmol/L 苯甲脒

1 mg/ml 抑胃酶肽 A

1 mg/ml 亮抑蛋白酶肽

1 mg/ml 抗蛋白酶

100 mmol/L DTT

仪器：

干冰/乙醇浴

具有多细胞皿架（金属网架最佳）的 37℃ 无循环水浴箱

50 ml 离心管

台式离心机

细胞刮片

带螺旋盖的微量离心管