渗透细胞蛋白磷酸化实验
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简介
本实验讨论用三磷酸核苷在可渗透细胞和分离的细胞组分体外标记蛋白的策略。这类实验在大多数情况下还是以 [γ-32P] ATP 作为外源性磷酸供体。尽管在特殊情况下[γ-32P] GTP 也能被用于蛋白质标记。
内容来源于《精编分子生物学实验指南（第五版）》
来源：丁香实验
操作方法
实验试剂及仪器具体要求见「其他」。1. 贴壁细胞培养：1.1 实验前约 1 h，将待标记细胞的培养液换为含有 20 mmol/L HEPES 的平衡培养液。重新放入培养箱，用新培养液平衡细胞。1.2 将细胞培养皿置于 37℃ 水浴中 10 min, 再次平衡细胞。吸弃皿中培养液，用 10 ml 37℃ 预热的胞外缓冲液迅速冲洗细胞 2 次，吸尽胞外缓冲液，加 0.5~2 ml 的有渗透性的缓冲液于
备择方案1 制备用于SDS-PAGE的天然细胞样品实验材料、试剂、仪器参见基本方案。1. 制备细胞并进行渗透性处理和标记（见基本方案步骤 1~8）。2.1 贴壁细胞培养。快速吸尽有渗透性的缓冲液，在每板中加入 100~250 ℃ 预冷的 2 × SDS-PAGE 样品缓冲液，停止反应。每板使用不同的细胞刮片迅速刮离细胞于缓冲液中，转移细胞样品至新的旋盖离心管中。2.2 悬浮细胞培养。在微量离心反应管中以最大速度离心 1 min, 室温。迅速吸尽上
备择方案2 制备用于等电聚焦的天然细胞样品实验材料、试剂、仪器参见基本方案。1. 制备细胞并进行渗透化处理和标记（见基本方案步骤 1～6)。2.1 贴壁细胞培养。快速吸掉有渗透性的缓冲液，每孔中加入 100～250 μl 4℃ 预冷的双向-PAGE 裂解缓冲液，停止反应。每板使用不同的细胞刮片刮离细胞于缓冲液中，将细胞样品转移到新的旋盖离心管中。2.2 悬浮细胞培养。室温，最大速度离心 1 min，迅速吸出并弃去上清。小心操作，切勿搅散
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