酶标抗体和酶-抗酶复合物的应用于免疫酶组化技术（APAAP法）

【基本原理】

碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶染色法(APAAP法)，是一种免疫组化技术。用兔抗鼠IgG起搭桥作用，其中一个Fab段连接McAb ，另一个Fab段连接APAAP复合物，再通过复合物中的碱性磷酸酶催化底物显色来判断抗原分子的存在。该方法由于使用免疫桥联技术，故其敏感性高，结果易于判断，同时又减少了内源性酶的影响，特异性强。目前已广泛用于淋巴细胞分化抗原、活化抗原、MHC-I、II类抗原表达的检测等。

【试剂及材料】

① APAAP试剂盒

② TBS缓冲液(pH7.6 0.05mol/L Tris-HCl)： Tris 30.25g，NaCl 40.0g，HCl 11ml，加蒸馏水溶解至500ml，调pH值至7.4～7.6。抗体稀释用含1％牛血清白蛋白的TBS。

③ Mayer苏木精复染液：苏木精0.1g，钾明矾5g，柠檬酸0.1g，水合氯醛5g，碘酸钠0.02g，蒸馏水100ml。将苏木精、钾明矾和碘酸钠溶于蒸馏水，再加温搅拌溶解，加柠檬酸和水合氯醛，混合后煮沸5min，冷却后过滤备用。

④ 纯丙酮

⑤ McAb

【操作方法】

① 取经过预处理（固定或脱蜡）的组织切片、细胞爬片或甩片；

④滴加二抗10～50μl，放湿盒内37 ℃温育30～60min，TBS浸洗5min，吸干；

⑤滴加APAAP复合物10～50μl，放湿盒内37 ℃，30～60min，TBS浸洗5min，吸干；

⑥滴加底物显色液10～50μl(临用前配制，取底物溶液1ml加坚固红1mg，充分溶解后使用)，放湿盒内37 ℃温育30min，TBS浸洗5min，擦片；

⑦加Mayer苏木精复染1min，用自来水冲洗。空气中干燥；

⑧高倍镜下观察：以细胞膜上或胞浆着红色为阳性细胞，无色者为阴性细胞，并计算阳性细胞百分率。

【附注】常用底物配制

1．辣根过氧化物酶（HRP）的常用底物配制

(1)H2 O2 /OPD：OPD 4mg溶于10ml pH5.0枸橼酸-磷酸盐缓冲液(0.1mol/L枸橼酸4.86ml加0.2mol/L Na2 PO4 5.14ml)中， 加入3%H2 O2 50ml混匀，避光。临用时配制。H2 O2 /OPD的呈色反应为棕色，比色波长为492nm。终止液为2mol/L H2 SO4 。

(2)H2 O2 /TMB（或TMBS）：用DMSO将TMB（或TMBS）配成10mg/ml原液，4℃保存。临用前用pH5.4枸橼酸-磷酸盐缓冲液(0.1mol/L枸橼酸8.85ml加0.2mol/L Na2 PO4 11.15ml)稀释成0.1mg/ml(TMB)或0.2mg/ml(TMBS)，每ml加入0.75%H2 O2 4.2ml，此溶液应在1h内使用。H2 O2 /TMB（或TMBS）的呈色反应为蓝色，比色波长为450nm。反应终止液为2mol/LH2 SO4 。

(3)H2 O2 /ABTS：ABTS 3mg溶于10ml 枸橼酸-磷酸盐缓冲液(0.1mol/L枸橼酸与0.2mol/L Na2 PO4 等量混合)中，加入3%H2 O2 10ml。H2 O2 /ABTS的呈色反应为绿色，比色波长为410nm。反应终止液为1.25%NaF。

(4)H2 O2 /DAB：DAB 4mg先溶于0.2mlDMSO或0.5ml丙酮，然后用0.01mol/L pH7.4 PBS补至10ml，加入30%H2 O2 50ml。H2 O2 /DAB的呈色反应为棕色，产物不可溶，常用于免疫组化染色，临用时配制。

2．碱性磷酸酶（AP）的常用底物

对硝基磷酸盐(PNP)： PNP 3mg溶于5ml 10%二乙醇胺缓冲液(二乙醇胺9.7ml，MgCl2・6H2 O 10mg，NaN3 20mg溶于蒸馏水，以1mol/L HCl校正为pH9.8，加水至100ml， 4℃保存