酶标抗体和酶-抗酶复合物的应用于细胞ELISA

应用酶标抗体进行免疫测定的方法较多，非均相酶免疫测定是目前应用最广泛的一类酶免疫检测技术，其中以酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）最常用，它可用于测定抗体，也可测定可溶性抗原及细胞抗原。

而酶-抗酶复合物多用于免疫组织化学。以下着重介绍ELISA（包括双抗体夹心法、细胞ELISA和斑点ELISA）和免疫酶组化技术（APAAP法）。

基本原理：先将以知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，再用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分，然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量。

细胞ELISA：该方法将细胞视为固相载体。多用于检测细胞表面的抗原或受体或筛选细胞表面抗原的特异性抗体。

试剂及配制

1. 洗涤液（pH 7.4 PBS)

KH2PO4 0.2g

Na2 HPO4--12H2 O 2.9g

NaCl 8.0g

KCl 0.2g

蒸馏水加至 1000ml

2. 一抗或配体和酶标抗体

操作方法

1. 将不同数量的阳性或阴性细胞与不同浓度的抗体进行反应，用以确定最适细胞数和抗体的工作浓度；

2. 将细胞悬液于4℃，1500r/min离心5min，弃上清，重悬于冰冷的洗涤液中，计数并调整细胞浓度；

3. 取锥形或圆形凹孔板，加入最适细胞数（1-undefined105 个/孔），100ml/孔，4℃，1500r/min离心5min，吸去上清；

4. 混合器短时振摇，使沉淀的细胞分散；

5. 加入一定稀释度抗体或配体，4℃孵育1.5h，间隔15min轻轻振摇一次；

6. 4℃，1500r/min离心5min，吸去上清；用洗涤液洗涤3次，弃上清；

7. 加入最适工作浓度酶标抗抗体或酶标抗体（抗配体），4℃孵育1.5h，间隔15min轻轻振摇一次；

8. 4℃，1500r/min离心5min，吸去上清；用洗涤液洗涤3次，弃上清；

9. 加入底物溶液，100ml/孔，避光室温显色20-30min，间隔10min轻轻振摇一次；

10. 4℃，1500r/min离心5min，转移上清至空孔中，用酶联检测仪测定OD值