荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）

实验原理

荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。

FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。

杂交所用的探针大致可以分类三类：

1）染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；

2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；

3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。

探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。

实验用具及材料

相关溶液的配制

1）20×SSC：175.3g NaCl，88.2g柠檬酸钠，加水至1000mL（用10mol/L NaOH调pH 至7.0）。

2）去离子甲酰胺（DF）：将10g混合床离子交换树脂加入100mL甲酰胺中。电磁搅拌30min，用Whatman l号滤纸滤。

3）体积分数70％甲酰胺/2×SSC：35mL甲酰胺，5mL 20×SSC，10mL水。

4）体积分数50％甲酰胺/2×SSC：100mL甲酰胺，20mL 20×SSC，80mL水。

5）体积分数50％硫酸葡聚糖（DS）：65oC水浴中融化，4oC或-20oC保存。

6）杂交液：8µL体积分数25％DS，20µL 20×SSC混合。（或40µL体积分数50％DS，20µL 20×SSC，40µL ddH2O混合）取上述混合液50µL，与5µL DF混合即成。其终浓度为体积分数10％DS，2×SSC，体积分数50％DF。

7）PI/antifade溶液

PI原液：先以双蒸水配置溶液，浓度为100µg/mL，取出1mL，加39mL双蒸水，使终浓度为2.5µg/mL。Antifade原液：以PBS缓冲液配制该溶液，使其浓度为10mg/mL,用0.5mmol/L的NaHCO3调pH值为8.0。取上述溶液1mL，加9mL甘油，混匀。

PI/antifade溶液：PI与antifade原液按体积比1:9比例充分混匀，－20oC保存备用。

8）DAPI/antifade溶液：用去离子水配制1mL/mg DAPI储存液，按体积比1:300，以antifade溶液稀释成工作液。

9）封闭液I：体积分数5％BSA 3mL，20×SSC 1mL,ddH2O 1mL,Tween20 5µL混合。

10）封闭液II：体积分数5％ BSA 3mL,20×SSC 1mL,goat serum 250µL,ddH2O 750µL,Tween20 5µL混合。

11）荧光检测试剂稀释液：体积分数5％ BSA 1mL，20×SSC 1mL,ddH2O 3mL,Tween20 5µL混合。

12）洗脱液：100mL 20×SSC，加水至500mL，加Tween20 500µL。

实验方法及步骤

1）探针变性

将探针在75oC恒温水浴中温育5min，立即置0oC，5～10min，使双链DNA探针变性。

2）标本变性

①将制备好的染色体玻片标本于50oC培养箱中烤片2～3h。（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。
②取出玻片标本，将其浸在70～75oC的体积分数70％甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。
③立即按顺序将标本经体积分数70％、体积分数90％和体积分数100％冰乙醇系列脱水，每次5min，然后空气干燥。

3）杂交

将已变性或预退火的DNA探针10μL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18×18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37oC杂交过夜（约15～17h）。由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。

4）洗脱

此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。

（1） 杂交次日，将标本从37oC温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。
（2） 将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50oC的体积分数50％甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5min。
（3） 在已预热42～50oC的1×SSC中洗涤3次，每次5min。
（4） 在室温下，将玻片标本于2×SSC中轻洗一下。
（5） 取出玻片，自然干燥。
（6） 取200μL复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。

5）杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针）

（1） 在玻片的杂交部位加150μL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37oC温育20min。
（2） 去掉保鲜膜，再加150μL avidin-FITC于标本上，用保鲜膜覆盖，37oC继续温育40min。
（3） 取出标本，将其放入已预热42～50oC的洗脱液中洗涤3次，每次5min。
（4） 在玻片标本的杂交部位加150μL封闭液II，覆盖保鲜膜，37oC温育20min。
（5） 去掉保鲜膜，加150μL antiavidin于标本上，覆盖新的保鲜膜，37oC温育40min。
（6） 取出标本，将其放入已预热42～50oC的新洗脱液中，洗涤3次，每次5min。
（7） 重复步骤(1)、（2）、（3），再于2×SSC中室温清洗一下。
（8） 取出玻片，自然干燥。
（9） 取200μL PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。

6）封片

可采用不同类型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液产生自封闭作用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在—20～—70oC的冰箱中的暗盒中保持数月之久。

7）荧光显微镜观察FISH结果

先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针所在的位置发出绿色荧光。

所用不同荧光材料的激发光和发射光波长及滤光镜选择