材料与仪器
SSC D-PBSA 糖原 RNase 多聚甲醛 甲酰胺
固定液 乙醇 杂交缓冲液 标记探针 橡胶乳黏剂 封固剂
固定液 乙醇 杂交缓冲液 标记探针 橡胶乳黏剂 封固剂
步骤
含有重复序列探针的沉淀：
大分子量黏粒探针往往含有重复序列，如果在杂交前不能封闭这些序列，将导致严重的非特异性杂交背景。人 Cot1 DNA 富含重复序列，可对黏粒的重复序列产生竞争性抑制，故杂交中加入 Cot1 DNA 可消除上述影响。在下述的操作步骤（b )中，可将 Cot1 DNA 一并沉淀。
(a) 就20 μl 的缺口平移标记反应体系而言，取 0.5，mol/L EDTA 1 μl，4 mol/L LiCl 2.5 μl，糖原 1 μl，100~1000 倍过量的人 Cot1 DNA ( Invitrogen ) 及乙醇 100 μl，与标记探针混合。
(b) 将其置于干冰上 30 min 或 -20 ℃ 过夜，使之沉淀。
(c) 在离心机中离心 15 min，以沉淀 DNA 。
(d) 用 70 % 乙醇洗涤沉淀。
(e) 离心使 DNA 再沉淀，室温晾干 DNA 。
(f) 以杂交缓冲液中重新稀释 DNA，浓度为 2~10 ng/μl。
不含重复序列探针的沉淀：
与前述方法基木相同，但需要将 Cot1 DNA 从沉淀中去除。
探针变性：
(a) 对于含有重复序列的探针，需要用 Cot1 DNA 将其封闭。将探针混合液加热至 70°C 10 min。将探针混合液 37°C 放置 1 h，然后涂在载玻片上。
(b) 对于不含重复序列的探针，将探针混合液加热至 70°C 10 min，然后将其在冰上冷却 10 min。
检测探针的 TBST 缓冲液，含 0.05% Tween20 ( 吐温），以 0.1 mol/ L Tris，0.15 mol/L NaCl ( pH 7.5 ) 配制
甲酰胺，以1X SSC 配成 50%
抗体：
(a) 第一抗体（一抗），如：抗地高辛或抗生物素的羊多抗血清；滴定法参见产品说明（Roche)
(b) 第二抗体（二抗），如：FITC-耦联的驴抗羊 IgG (JacksonlmmunoresearchInc.)
(c) 用含 3% 牛血清白蛋白（BSA ) 的 TBST 稀释抗体
染色体的制备与变性：
1. 用规范技术制备中期静止细胞（见方案16. 7 及方案27. 5)，将固定的细胞滴至载玻片上，用钻石刻笔做好区域标记。
2. 用新配制的甲醇及乙酸（3 : 1 ) 固定液再次固定细胞 1 h，然后晾干载玻片。
3. 于室温下用 2X SSC 淋洗玻片 2 min。
4. 于 37°C 条件下，用含 100 μg/ml RNase 的 2X SSC 温育 1 h。
5. 用 D-PBSA 淋洗。
6. 室温下用新制备的含 1 % 多聚甲醛的 D-PBSA 再固定 10 min (此过程为可选步骤）。
7. 用 D-PBSA 淋洗。
8. 用 70 % 和 100% 乙醇进行两轮脱水，每次 2 min，然后风干载玻片。
9. 于 70°C 条件下，用含 70 % 甲酰胺 2X SSC 变性染色体 2~4 min (从 2 min 开始尝试，以确定实验的适宜时间），在使用 70% 甲酰胺前先确信其温度为 70°C。
10. 用冰冷的 70% 乙醇分次淋洗玻片。
11. 重复步骤 8 中的脱水操作，并且晾干玻片。
12. 此时的染色体可用于杂交反应。
杂交：
13. 在铺布细胞的区域内滴加 10 μl 变性探针（标记探针：大分子量的黏粒克隆很适于作为检测单拷贝基因的探针，但 cDNA 探针同样可以使用。采用商品试剂盒，将 DNA 用缺口平移法标。Roche (以前是BoehringerMamiheim) 生产的缺门平移试剂盒可用于生物素或地高辛掺人，详情可参照产品说明。），用 22mm X 22 mm 的盖玻片覆盖此区域。
14. 用橡胶乳黏剂将盖玻片四周封闭住。
15. 载玻片在 37°C 饱和湿度的孵箱中过夜。
探针检测：
16. 次日取出载玻片，浸入 2X SSC 中，揭去盖玻片（室温下），清除外周的胶黏剂，将载玻片置于一个 Coplin 瓶中。
17. 42°C 条件下，用含 50 % 甲酰胺的 1X SSC 浸泡载玻片 2 次，每次 10 min。
18. 42°C 条件下，用 2X SSC 液淋洗载玻片2 次，每次 10 min。
19. 用 TBST 淋洗。
20. 37°C 条件下，将载玻片在含 3% 牛血清白蛋白的 TBST 中孵育 30~60 min，以封闭非特异性结合。
21. 将一抗（第一抗体）滴加到载玻片上，每个载玻片用 100 μl 抗体，用 Parafilm 封盖每个载玻片。
22. 37°C 条件下，孵育载玻片 1 h。
23. 室温下，用 500 ml TEST 淋洗载玻片。
24. 将 3% BSA/TBST 稀释的荧光素耦联二抗液滴加到载玻片上，二抗的使用效价（滴度）参见产品说明或者自己摸索。
25. 37°C 条件下，孵育 30 min。
26. 室温下用 500 ml TBST 淋洗 30 min。
27. 用含 0.8 μg/ml 的二氨基苯基吲哚（DAPI ) 和（或）含 0.4 μg/ml 碘化丙锭(PI) 的 TBST 复染 10 min，用抗消色玻片封盖。
28. 通过相应的滤片组合，用荧光显微镜观察载玻片上的细胞。
大分子量黏粒探针往往含有重复序列，如果在杂交前不能封闭这些序列，将导致严重的非特异性杂交背景。人 Cot1 DNA 富含重复序列，可对黏粒的重复序列产生竞争性抑制，故杂交中加入 Cot1 DNA 可消除上述影响。在下述的操作步骤（b )中，可将 Cot1 DNA 一并沉淀。
(a) 就20 μl 的缺口平移标记反应体系而言，取 0.5，mol/L EDTA 1 μl，4 mol/L LiCl 2.5 μl，糖原 1 μl，100~1000 倍过量的人 Cot1 DNA ( Invitrogen ) 及乙醇 100 μl，与标记探针混合。
(b) 将其置于干冰上 30 min 或 -20 ℃ 过夜，使之沉淀。
(c) 在离心机中离心 15 min，以沉淀 DNA 。
(d) 用 70 % 乙醇洗涤沉淀。
(e) 离心使 DNA 再沉淀，室温晾干 DNA 。
(f) 以杂交缓冲液中重新稀释 DNA，浓度为 2~10 ng/μl。
不含重复序列探针的沉淀：
与前述方法基木相同，但需要将 Cot1 DNA 从沉淀中去除。
探针变性：
(a) 对于含有重复序列的探针，需要用 Cot1 DNA 将其封闭。将探针混合液加热至 70°C 10 min。将探针混合液 37°C 放置 1 h，然后涂在载玻片上。
(b) 对于不含重复序列的探针，将探针混合液加热至 70°C 10 min，然后将其在冰上冷却 10 min。
检测探针的 TBST 缓冲液，含 0.05% Tween20 ( 吐温），以 0.1 mol/ L Tris，0.15 mol/L NaCl ( pH 7.5 ) 配制
甲酰胺，以1X SSC 配成 50%
抗体：
(a) 第一抗体（一抗），如：抗地高辛或抗生物素的羊多抗血清；滴定法参见产品说明（Roche)
(b) 第二抗体（二抗），如：FITC-耦联的驴抗羊 IgG (JacksonlmmunoresearchInc.)
(c) 用含 3% 牛血清白蛋白（BSA ) 的 TBST 稀释抗体
染色体的制备与变性：
1. 用规范技术制备中期静止细胞（见方案16. 7 及方案27. 5)，将固定的细胞滴至载玻片上，用钻石刻笔做好区域标记。
2. 用新配制的甲醇及乙酸（3 : 1 ) 固定液再次固定细胞 1 h，然后晾干载玻片。
3. 于室温下用 2X SSC 淋洗玻片 2 min。
4. 于 37°C 条件下，用含 100 μg/ml RNase 的 2X SSC 温育 1 h。
5. 用 D-PBSA 淋洗。
6. 室温下用新制备的含 1 % 多聚甲醛的 D-PBSA 再固定 10 min (此过程为可选步骤）。
7. 用 D-PBSA 淋洗。
8. 用 70 % 和 100% 乙醇进行两轮脱水，每次 2 min，然后风干载玻片。
9. 于 70°C 条件下，用含 70 % 甲酰胺 2X SSC 变性染色体 2~4 min (从 2 min 开始尝试，以确定实验的适宜时间），在使用 70% 甲酰胺前先确信其温度为 70°C。
10. 用冰冷的 70% 乙醇分次淋洗玻片。
11. 重复步骤 8 中的脱水操作，并且晾干玻片。
12. 此时的染色体可用于杂交反应。
杂交：
13. 在铺布细胞的区域内滴加 10 μl 变性探针（标记探针：大分子量的黏粒克隆很适于作为检测单拷贝基因的探针，但 cDNA 探针同样可以使用。采用商品试剂盒，将 DNA 用缺口平移法标。Roche (以前是BoehringerMamiheim) 生产的缺门平移试剂盒可用于生物素或地高辛掺人，详情可参照产品说明。），用 22mm X 22 mm 的盖玻片覆盖此区域。
14. 用橡胶乳黏剂将盖玻片四周封闭住。
15. 载玻片在 37°C 饱和湿度的孵箱中过夜。
探针检测：
16. 次日取出载玻片，浸入 2X SSC 中，揭去盖玻片（室温下），清除外周的胶黏剂，将载玻片置于一个 Coplin 瓶中。
17. 42°C 条件下，用含 50 % 甲酰胺的 1X SSC 浸泡载玻片 2 次，每次 10 min。
18. 42°C 条件下，用 2X SSC 液淋洗载玻片2 次，每次 10 min。
19. 用 TBST 淋洗。
20. 37°C 条件下，将载玻片在含 3% 牛血清白蛋白的 TBST 中孵育 30~60 min，以封闭非特异性结合。
21. 将一抗（第一抗体）滴加到载玻片上，每个载玻片用 100 μl 抗体，用 Parafilm 封盖每个载玻片。
22. 37°C 条件下，孵育载玻片 1 h。
23. 室温下，用 500 ml TEST 淋洗载玻片。
24. 将 3% BSA/TBST 稀释的荧光素耦联二抗液滴加到载玻片上，二抗的使用效价（滴度）参见产品说明或者自己摸索。
25. 37°C 条件下，孵育 30 min。
26. 室温下用 500 ml TBST 淋洗 30 min。
27. 用含 0.8 μg/ml 的二氨基苯基吲哚（DAPI ) 和（或）含 0.4 μg/ml 碘化丙锭(PI) 的 TBST 复染 10 min，用抗消色玻片封盖。
28. 通过相应的滤片组合，用荧光显微镜观察载玻片上的细胞。
注意事项
抗体的组合使用一定要正确， 例如：如果使用抗地高辛的羊多抗血清作为第一抗体， 那么第二抗体就必须是 FITC -耦联的驴抗羊 IgG 抗体。
来源：丁香实验
