EMSA实验问题与解答
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以下问题是以Promega公司试剂盒为例。
凝胶迁移实验
在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
Promega公司的Riboprobe?/sup系统（a,b）（目录号P1420，P1430，P1440，P1450，P1460）可用于同位素标记的RNA的体外合成，DNA5`末端标记系统（目录号U2010）用于制备DNA探针，结合反应所需的组分有：含盐的溶液（氯化镁，氯化钠，或氯化钾）、缓冲体系（Tris-HCl或HEPES）、还原剂（DTT）、甘油、非特异的竞争DNA（poly(dI:dC)?dI:dC)，也可能含非离子去污剂。在结合蛋白和同位素标记的探针作用后，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物，随后将凝胶干燥并放射自显影，或用PhosphorImage?/sup分析。
AP2抽提液是从表达AP2蛋白的大肠杆菌中提取的。另外，Core系统还含SP1同源寡核苷酸，凝胶迁移结合缓冲液（5′），和能作20次对照实验的HeLa核抽提液。Complete系统（目录号E3300）含另外5个双链寡核苷酸，分别是AP1、OCT1、CREB,、NF-k B、 TFIID结合位点的同源序列。这些寡核苷酸可以在末端标记后用作特异性探针，或在竞争实验中用作非特异性探针。参考凝胶迁移实验技术手册TB110获取更多的资料。
总之，反应总体积应最小（20ul）。为满足一般要求，结合缓冲液含4%甘油，1mMMgCl2, 0.5mMEDTA, 0.5mMDTT, 50mMNaCl, 10mMTris-HCl(pH7.5), 0.05mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC,或10mMHEPES(pH7.9), 50mMKCl, 1mMDTT, 1mMEDTA, 10%甘油，0.05mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC可作为优化实验的起始。参考凝胶迁移实验技术手册TB110获取更多的资料。
5)提供了哪些同源的多核苷酸引物，这些引物的序列来源是什么？
有各类dsDNA探针，它们含各种转录调控因子的同源结合位点。下表列出了所能提供的探针，和这些引物序列的出处。
转录调控因子探针
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探针名 目录号 序列（上链） 序列的出处
Sp1 E3231,E3232 5`-ATT CGA TCG GGG CGG G GC GCG-3` SV40启动子（1）
AP1 E3201 E3202 5`-CGC TTG ATG AGT CA G CCG GAA-3` 胶原酶基因TRE（2）
AP2 E3211 E3212 5`-GAT CGA ACT GAC CGC CCG CGG C CC GT -3`人金属硫堇II a(3)
基因NF-kB E3291, E3292, 5`-AGT TGA GGG GAC TTT CC C AGG C-3`鼠Igk轻链基因（4）
Oct1 E3241 E3242 5`-TGT CGA ATG CAA AT C ACT AGA A-3` Ig重链基因（5）
CREB E3281 E3282 5`-AGA GAT TGC CTG ACG TCA GAC AG C TAG-3`大鼠生长激素抑制基因（6）
TFIID E3221 E3222 5`-GCA GAG CAT ATA A GG TGA GGT AGG A -3`belta-1球蛋白启动子
只列出了上链的序列，探针是双链，下链序列和上链序列配对。黑体字表明序列来源于指定的基因序列，转录调控因子结合的序列用下线表明。一般而言，周围的核苷酸是任意。
目的DNA的长度应小于300bp，以有利于非结合探针和蛋白DNA复合物的电泳分离。双链的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝胶迁移实验中用作探针。如目的蛋白已被鉴定，则应用短的寡核苷酸片段（约为25bp）,这样结合位点可和其他因子的结合位点区别开。长的限制性酶切片段可用于对推定的启动子/增强子区域内的蛋白结合位点定位。随后可用DNaseI 印迹对蛋白结合的特异区域在DNA序列水平上作出分析。
7)用以下一些转录调节因子和HeLa细胞核抽提物可形成哪些复合物：AP1, AP2, CREB, NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB。
1．AP1：AP1（激活蛋白1）是一个转录调节因子，它结合的同源序列为5`-TGAGTCA-3`。当基因的启动子区域存在AP1的结合位点时，这些基因可以被诱导，比如用佛波酯可诱导蛋白激酶C（2，7）。在细胞中，AP1形成c-Jun或Jun相关蛋白的同聚双体，或者形成c-Jun或Jun相关蛋白和c-Fos或Fos相关抗原（Fras）的异源双体。Fos蛋白自身不能形成同聚双体，并不能单独和AP1结合位点结合。c-Jun蛋白是一个40kDa的单体蛋白并通过亮氨酸拉链形成同聚双体。
当研究含TFIID和TFIIB的复合物时，应从结合缓冲液，凝胶，和电泳缓冲液中去除MgCl2。这些是一般的要求，用不同的细胞抽提物和TFIID、TFIIB形成复合物作凝胶迁移实验时，应对多种因素进行优化以达到理想的条件。
8)在一次凝胶迁移实验中，用多少量的蛋白质或抽提物，和标记的DNA探针？
所加入反应的探针的量是50，000-200，000cpm32P-标记的探针（高特异活性），反应体积为1-5ul。这相当于10-50fmoles的DNA探针。探针应保存在-20oC以防止降解，在合成或标记后1-2个星期内必需使用。无论探针或是结合蛋白应避免多次冻融。
TNT？/sup>T7偶联的麦胚抽提物（b,c,d,e）在体外翻译了c-Rel。这一蛋白特异地使免疫球蛋白k 轻链增强子探针产生迁移。在c-Rel结合反应中加入体外翻译的MAD-3（IkB家簇中一员）可干扰其相互作用。
10)poly(dI:dC)?dI:dC)，非特异性竞争DNA，特异性竞争DNA的功能是什么？
它由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构，可抑制蛋白对标记探针的非特异结合，避免假复合物。 在凝胶迁移反应中加入poly(dI:dC)?dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中其它DNA结合蛋白结合，比如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)?dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)?dI:dC)。
11)用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针分离开？
将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合，蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为6%（30：1丙烯酰胺：双叉），在特定条件下可用高或低的浓度。
如复合物不进入凝胶则表明所用的蛋白或探针过量，或盐的浓度过量不适用于这一反应。在含抽提液的带中不含游离探针或复合物，但只含探针的带中有探针表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂。目前可用高强度琼脂糖凝胶分离蛋白/探针复合物（Metaphor?/sup/agarose）。
需用均质标记的探针，因DNA酶会从末端标记的探针中除去标记。和保护的几个核苷酸交联的蛋白在变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离，干燥，放射自显影。结合蛋白的分子量可和标准分子参照物比较。也可用目的蛋白的抗体对复合物作Western印迹分析（20）。如一个蛋白和DNA探针的特定序列结合，可用含保守结合序列的竞争寡核苷酸，以及突变体来确定它的特征。也可用定点突变将保守序列结合位点改变来研究复合物的形成。
参考资料
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使用了Promega 公司凝胶迁移实验产品的参考资料
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