引物延伸实验问题与解答
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1)什么是引物延伸实验？
引物延伸实验用于定量mRNA的量，测定低丰度的mRNA的种类。另外引物延伸实验可标定转录产物的5`-端， 确定转录的精确起始。特异的末端标记的引物退火到RNA链的互补区域， 随后用RNA作为模板，用反转录酶延伸引物得到cDNA，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析cDNA。cDNA的长度为引物的标记的核苷酸到RNA-5`末端间的碱基数，所得cDNA的量和目的RNA的起始量成正比。理想的引物是ssDNA, 长度为20-40个核苷酸，与要分析的转录产物的5`末端区域互补。延伸产物小于150个核苷酸，可得到最佳分离效果。引物延伸实验非常灵敏，可检测2pg的转录产物，这相当于1个细胞中的1个RNA。引物延伸实验非常适合于对单个基因作定量和定性分析。
2)作这样一个实验必须用什么试剂？
引物延伸实验需要模板RNA，可用总RNA或poly(A)+RNA。一个特异的末端标记的核苷酸或DNA片段作为引物，用反转录酶合成cDNA。除RNA模板和标记的引物，还需要反转录酶，AMV或MMLV反转录酶、反应溶液、脱氧核苷酸、聚丙烯酰胺凝胶试剂，和电泳装置。所得结果用放射自显影和磷成像仪分析。
3)引物延伸系统中有些什么组分？
引物延伸系统中AMV反转录酶和反应溶液、焦磷酸钠、正对照RNA模版和对照引物、去磷酸的PhiX174Hinf I DNA 标准分子参照物、T4多核苷酸激酶和溶液、样品溶液、AMV 反转录酶 2X溶液 100mMTris-HCl（pH8.3, 42oC）、100mM KCl、 20mMMgCl2、20mMDTT、2mM每一种dNTP、1mM精胺。PhiX174标准分子参照物和T4 多核苷酸激酶用作引物标记，和确定延伸产物长度的标准。对照RNA可得到87个碱基的延伸产物作为正对照。参照技术手册TB113查阅引物延伸系统和AMV反转录酶的其它信息。
4)反应中用焦磷酸钠的目的是什么？
引物延伸反应中用焦磷酸钠和精胺可增加全长cDNA的得率，抑制模板RNA产生发卡结构。虽然其作用方式未确定，但结果是增加全长cDNA的得率，抑制模板RNA产生发卡结构。MMLV被焦磷酸钠和精胺抑制，如使用MMLV，放线菌素D可用于增加全长cDNA的得率，抑制模板RNA产生发卡结构。焦磷酸钠和放线菌素D抑制cDNA第二条链的合成。
5)为成功进行引物延伸实验需对哪些因素作优化？
引物延伸实验中所用的杂交温度是最关键的需优化的因素。一般而言，最高紧密度，或引物和互补序列完全杂交所需的最适条件是，低于引物溶解温度的5oC。低于最高紧密度的温度可极大地增加杂交速度。应在不同的紧密度的杂交温度下作杂交，以控制引物和特异RNA的杂交。增加杂交紧密度时，带来的延伸产物的丢失表明，引物和相关的却不是等同的转录产物杂交。在碱和双价阴离子的存在下，RNA在较高温度会降解，应用甲酰胺杂交操作方案，这可有效降低溶解温度，因此可使杂交在较低的温度进行。可在杂交步骤中用以下的溶液：40mMPIPES、1mMEDTA、0.4mM NaCl、80%的甲酰胺。如用这个杂交溶液，延伸步骤前甲酰胺和盐需用乙醇沉淀后除去。
模板RNA和引物的量需优化。以下讨论了所用RNA模板和引物的起始量。反转录酶对不同模板使用的效率不同。这部分是由于RNA中存在的次级结构干扰反转录酶的聚合酶活力。如产生短的产物，这通常不是一个问题。如用AMV反转录酶，延伸温度可达55oC。
6)每次反应所用RNA的量是多少？
每次反应所用RNA和引物的量取决于分析的RNA的种类（总RNA或poly(A)+RNA）,目的RNA的相对丰度。如用总RNA，起始量为10ug，但分析稀有信号，每次反应用100 ugRNA。poly(A)+RNA每次反应用0.1-1.0 ug，具体决定于总RNA中poly(A)+RNA的富含量，需分析的特异RNA的浓度。在引物延伸分析前需检查目的RNA的完整。通过凝胶分析总RNA，应有完整的18S和28S核糖体RNA带。在引物延伸反应中用Northern印迹和RT-PCR分析来确定特定RNA的存在。
7)每次反应所用引物的量是多少？
用引物延伸实验定量RNA，标记的引物必须多于目的RNA。引物应是互补RNA的5-10倍。但一般，总RNA或poly(A)+RNA中，特定目的RNA量未知。对未分析的转录物，初次分析用50 ug总RNA和100fmol引物。如所有RNA中与引物互补的位点饱和，测试信号和投入的RNA的量成正比，而不依赖于引物的浓度。引物应至少为20个核苷酸，杂交位点应位于转录产物5`-末端下游的100个碱基处，而不会自互补。也可用从限制性酶切片段所得的ssDNA作为探针，长度应不长于50-100个核苷酸，以获得最佳分辨率。
8)用AMV和MMLV各有哪些优点和缺点？
引物延伸反应通常用AMV，AMV性能更好，对次级结构耐受。用AMV的延伸温度可达55oC, 以消除次级结构，但在这样温度下，引物延伸反应的得率通常降低。MMLV的最适温度为37 oC，在更高温度下，MMLV不稳定，但MMLV可合成更长的产物，这一特点对引物延伸反应不适用，因引物延伸反应所得的产物一般较短，为100-500个核苷酸。
9)有哪些因子会导致非特异，短的和多个引物延伸产物？
所研究的转录的差异程度可导致产生不同长度的延伸产物，它们来源于选择式剪切和使用不同的转录起始位点。差异核RNA的存在也能导致产生多个延伸产物。引物和RNA中相关或无关序列的交叉杂交也会导致非特异延伸产物的产生。产物短于预测可能和RNA模板的降解有关，或者是转录产物中次级结构阻制了反转录酶的合成，产生断缺的cDNA。RNA样品中存在DNA污染同样可得延伸产物，加放线菌素D（75ug/ml）可抑制这类产物的产生。应作无RNA模板的负对照实验，以确定所用试剂中无RNA和DNA污染。同时还应用从不表达目的转录产物的细胞或组织中提取的RNA模板作负对照实验。
10)如何计算RNA转化为cDNA的量？
RNA转化为cDNA的量可对引物延伸产物，和`无RNA`对照实验的cpm作测量得到。从凝胶中分别切割引物延伸产物和`无RNA`对照实验中产物，在闪烁液中测定凝胶块的读数，可有效平衡聚丙烯酰胺凝胶的湮灭和32P的衰退。
以下的例子表明如何计算fmol的RNA转化为cDNA，在这个例子中，一半的引物延伸产物（20ul/40ul）加入凝胶中作分析。`无RNA`对照实验的引物浓度为100 fmol，一半的反应液加入凝胶中作分析。切割的带的读数为：
首先计算引物cpm/ fmol：cpm/ fmol=142359 cpm/[100 fmolX（20/40）]=2847 cpm/ fmol
接下来计算引物延伸产物的fmol，或cDNA：3912 cpm/[2847 fmolX（20/40）]=2.75 fmol cDNA。所得值表明引物延伸中所得的cDNA的量。
11)用什么分子标准参照物确定引物延伸产物的精确长度？
为确定引物延伸产物的精确长度，应同同位素标记的DNA分子标准参照物对照。DNA分子标准参照物末端作了标记，上变性凝胶前先作变性，引物延伸产物也作变性。长度在20-500核苷酸范围的分子标准参照物在确定引物延伸产物的长度方面很有用。去磷酸的PhiX174Hinf I DNA 标准分子参照物非常方便，已去磷酸，可作5`末端标记，分子标准参照物的长度为24-726核苷酸。
12)能用测序胶分离引物延伸产物吗？
用于引物延伸产物分离的聚丙烯凝胶的规格为16X18cm, 含8%聚丙烯、7M尿素、1′TBE溶液。这种胶和测序胶很相似，故一般可用测序胶。应注意不使引物延伸产物和自由引物跑到胶外，特别是需对cDNA定量时。
有关文献：
1. Krug, MS, and Berger SL (1987) Meth Enzymol 152, 316
1. Boorstein WR and Craig EA (1989) Meth Enzymol 180, 347
3. Sambrook J Freitsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York
4. Freeman W M, Vrana SL, and Vrana KE (1996) Biotechniques 20, 782
