[转帖]蛋白质体外磷酸化的操作步骤及一点点体会

摘要：在细胞的发展过程及其各种重要功能中，可逆的蛋白质磷酸化扮演了重要的角色。我们在做实验的过程中证明蛋白质体外磷酸化的实验经常碰到。在此，我以一种蛋白质激酶为例介绍蛋白质体外磷酸化的方法；同时，谈谈我做这个实验的一点点心得。希望对大家有点帮助。

主要试剂：

10x磷酸化buffer(200mM tris-HCl PH7.5 ,500mMKCl,100mM MgCl )

PBS, 1xSDS电泳缓冲液 6xSDS加样缓冲液（参考精编分子实验指南第二版）

2pMATP γ-32P-ATP

主要步骤：

1、 蛋白准备

表达GST融合蛋白，用亲和层析纯化好，理论上越纯越好，但如果能够用20x40cm的SDS-page胶能分得很开就可以了。然后用1x的磷酸化buffer透析过夜（4度），再测好浓度定量总蛋白。分装10ug/管，保存到-80度备用。

2、 配制SDS-Page胶

用20x40cm的胶配两层胶：分离胶和积成胶（参考精编分子实验指南第二版p330页），先配12%的分离胶，灌胶以后用水封胶（如果是用凡士林封的胶室则不能用正丁醇封胶，因为是有机溶剂会溶掉凡士林，配胶不会成功,这一步我可是摸了三次的，开始用异丙醇，胶全滑了，再不封则不齐，上面有锯齿状），凝胶45分钟以上，倒去封胶的水，用滤纸吸干，再配积成胶，插上1mm的配套的梳子

以上两步最好在实验的前一天准备好

3、 磷酸化反应

这天最好早点来，吃好早餐（因为中午要吃得比较晚啦），来了把蛋白（记得要把阳性和阴性蛋白拿出来哟）和磷酸化buffe拿出来解冻。开好同位素房的水浴锅了，然后就好象做酶切一样简单的加样了，只不过要小心了，有同位素哟！（10x磷酸化buffer 3ul; 2pM的ATP 1ul; 蛋白激酶1ul; γ-32P-ATP 0.5ul; 蛋白2ug，加水补足到30ul），30度水浴，45分钟

4、 bind 到GST珠子上

在水浴时，回来用磷酸化buffer活化GST珠子(一般每个样用50%的珠子60ul)等磷酸化反应完后加入珠子，然后用磷酸化buffer补足到总体积500ul，37度结合1h。这时就可以去吃中饭了，不过不要想着休息了，马上回来

5、 洗freeγ-32P-ATP

用1XPBS （含0.1%的triton）洗4次（500g 2min 去上清），每次洗时都最好检测一下同位素照度看有否变化，照度一般在500到1000左右，同时要注意不要把珠子吸掉罗，否者老板要k你的。最后一次一定要吸干，

6、 洗脱、变性蛋白质

加入20ul PBS 和4ul 6xSDS加样缓冲液，放在105度，8min，这时要注意不要让液体溅出，兄弟，有同位素呢，变性蛋白以后马上放在冰上。

7、 SDS-PAGE凝胶电泳

就和做western一样，装好电泳槽，在上下槽上加好1xSDS电泳缓冲液，用注射器冲打点样孔，然后点样，先40mA电泳，待样电泳出积成胶就可调高电压到60mA，待溴酚兰快要分离胶了，就停下来

8、 干胶，放射自显影

以上实验步骤屡试不爽，每次都有正确的漂亮的结果。希望能对各位有点帮助。