酿酒酵母培养基配方与酵母细胞培养和诱导表达方法

互联网2013-08-27

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第一部分酿酒酵母培养基和培养平板配方

所有的液体培养基需用磷酸缓冲液配制：Na2HPO4-7H2O, 10.19g/L, NaH2PO4-H2O 8.56g/L. 称量好所需组分，先把氨基酸、氮源等添加到水中，再添加糖最后添加10X的磷酸缓冲液。液体培养基的PH需在6.25左右。

液体选择培养基和丰富培养基可以选择过滤除菌，但是琼脂平板培养基必须高压灭菌

丰富非选择培养基

2 x (YEPD or) YPD = Yeast Extract Peptone Dextrose

20g酵母粉 yeast extract(OXOID LP0021)

40 g 蛋白胨peptone (OXOID LP0042)

40g葡萄糖 dextrosundefined~A国药 14434-43-7)

把除葡糖糖之外的所有组分加入500ml水中溶解，定容至900ml，高压灭菌

配置20%的葡萄糖过滤除菌，添加100ml。

室温保存1-2个月。

~undefined也可以所有组分一起灭菌，但是可能会发生焦化作用，然而焦化作用不会引起任何问题。

生长选择合成培养基(Selective Growth Synthetic Media)

2x (SD – CAA)

1)用于EBY100菌株配套 pYD 系列载体，或者二配体酵母配套pPNL20 和pPNL30 载体

10 g/L 酪蛋白水解物casamino acids (-ade, -ura, -trp)(库存货号：Fluka A2427-250G)

40g/L 葡萄糖dextrose(国药 14434-43-7)

14g/L YNB Yeast Nitrogen Base with ammonium sulfate w/out amino acids (SIGMA Y0626)

5.4 g/L Na2HPO4(国药10039-32-4)

7.4 g/L NaH2PO4(国药14431-43-7)

2)用于YVH10 with pPNL30系列载体

10 g/L 酪蛋白水解物(casamino acids (-ade, -ura, -trp)

40g/L 葡萄糖dextrose

14g/L YNB (Yeast Nitrogen Base with ammonium sulfate w/out amino acids )40mg/L色氨酸( tryptophan)

5.4 g/L Na2HPO4

7.4 g/L NaH2PO4

3)用于JAR with pPNL20系列载体

10 g/L 酪蛋白水解物(casamino acids (-ade, -ura, -trp) (BD Bacto #223050)

40g/L 葡萄糖dextrose

14g/L YNB (Yeast Nitrogen Base with ammonium sulfate w/out amino acids ) (BD Difco 233520)

20mg/L 尿嘧啶 Uracil

5.4 g/L Na2HPO4

7.4 g/L NaH2PO4

Selective scFv (or Fab or ligand) Induction Media

抗体scFv (or Fab or 配体)的选择诱导培养基

2x (SG-CAA)

10 g/L酪蛋白水解物casamino acids (-ade, -ura, -trp) (BD Bacto #223050)

2 g/L半乳糖 galactose

2 g/L棉子糖 raffinose

0.1 g/L葡萄糖 glucose

14g/L YNB Yeast Nitrogen Base with ammonium sulfate w/out amino acids (BD Difco 233520)

5.4 g/L Na2HPO4

7.4 g/L NaH2PO4

YEPGR or YPGR = Yeast Extract Peptone Galactose/Raffinose

10g 酵母粉yeast extract

20 g 蛋白胨peptone

2%半乳糖 galactose

2%葡萄糖 raffinose

14g/L YNB Yeast Nitrogen Base with ammonium sulfate w/out amino acids (BD Difco 233520)

5.4 g/L Na2HPO4

7.4 g/L NaH2PO4

尿嘧啶和色氨酸母液的配置

色氨酸配制成4mg/ml的100X的母液，过滤除菌

尿嘧啶配制成2mg/ml的100X的母液，过滤除菌

酵母培养基的配置和选择

培养基的种类：应用最广泛的酿酒酵母培养基是YPD培养基(酵母粉、蛋白胨、葡萄糖)，单克隆在YPD上的生长通常受尿嘧啶、精氨酸和色氨酸的限制。额外的添加这些组分克隆的形成将会加快加大。合成培养基由盐(基本氮源和硫酸胺)碳源(比如葡萄糖)和其他组分(核苷酸和氨基酸)组成。合成培养基可以用drop in” 或者“drop out” 的策略筛选特定原养型菌株

“Drop out”

这种培养基是成分确定的营养丰富的培养基，其中添加很多氨基酸和核苷酸来支持菌株的生长。菌株可以在这种培养基中快速生长，接近在YPD平板上的生长速度，“Drop out”培养基通常称为完全合成培养基，简称SC，缺失某一种氨基酸或者核苷酸可以选择特定的原养型。

“Drop in”培养基仅包括基本的组分(盐和汤)和菌株生长所需的特定氨基酸和核苷酸。菌株必须用这些需分合成大部分生长所需的前体。“Drop in”培养基通常称为葡萄糖合成培养基，简称SD。简单的组分降低了成本并且容易配置，但是克隆形成时间将会慢两倍。并且SD培养基不易保存(4℃放置两个月即失效)

酵母菌株可以以穿刺菌、液体饱和培养物、平板的形式保存，有些时候甚至可以保存在Whatman滤纸上。收到菌株后最好摇一批新鲜的菌液冻存甘油菌。虽然酵母可以在4℃平板上放置几个月仍然可以存活，然而存活的菌株多样性却在下降。为了避免部分菌株的富集导致群体性质与原来相比出现偏离，接到菌株后需要马上冻存。

在某些时间验证至少两个克隆的选择标记是很有必要的。

你会注意到，有一些微小菌落(通常占群体的1 -10%)在丰富培养基上生长缓慢(在非发酵性碳源培养基中不能生长，比如葡萄糖)。这些微小菌落在YPD培养基上呈现典型的牛奶白色，而正常的克隆则呈奶油色。这种现象可以通过保存甘油菌避免

酵母菌株可以在含15%甘油的YPD中保存数年，不需在干冰/乙醇上快速冷冻。要确保冷冻前菌液和甘油培养基混合均匀。

需用新鲜培养的细胞冻存菌种，可以从固体平板上挑取菌落冻存(挑取火柴头大小的一块)或者取液体培养的菌株(离心取大约5 x 107 个细胞)。可以直接从选择培养基上取菌株用YPD/甘油冻存

第二部分酵母细胞的培养和scFv/Fab/toxin agment/ligand的诱导表达

1. 从-80取甘油菌划SD-CAA(转化菌或者二配体酵母)或者YPD(只限野生型菌株)，30度培养2d，挑取单克隆。接种2-5ml SD-CAA or YPD(野生型菌株培养，用于转化)250rpm，30℃，培养过夜。

2. 过夜培养菌OD600应该在1-3之间，即使在丰富培养集中也不会超过7，在选择培养基中不会低于1。在倒置显微镜中观察菌株的状态和是否被污染

3. 如果没有污染菌株状态良好，用1.5ml eppendorf 离心管13000rpm离心1-2min或者用15 ml fulcon 管3000rpm离心5min

4. 对于scFv or Fab的诱导展示，用SG-CAA重悬细胞，调整细胞密度至OD600 = 1-2，18℃，250rpm，摇24-48h。

5. 离心收集细胞，用FACS缓冲液冲洗，用Alexia 488 labeled Anti-SV5 antibody在流式细胞仪(LSA II or Aria).检测scFv/Fab的表达

6. 对于文库构建或者单克隆的转化，参照LiAc 转化方法 (part 5 or 6)