时间分辨荧光免疫分析原理（图）

荧光法是一种非常有用的工具，各种各样的分析领域都在利用它。由于它具有高灵敏度、好的选择性以及可提供多参数信息（如，荧光强度、荧光寿命、荧光各向异性）等特点，所以被广泛用于生物制药研究、临床诊断、宇宙空间环境监测、免疫分析中分子间作用原理研究、DNA序列分析、荧光原位杂交以及细胞成分分析等。镧系系复合物由于其特有的荧光特性，而受到广泛关注，特别是在临床生化分析中。利用镧系元素的荧光特性，构建时间分辨荧光免疫分析（time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA）试剂以及创建新的灵敏度高的荧光免疫分析方法（fluoroimmunoassay）是当今临床生化的主要研究方向。

1、荧光基本原理：

化学体系的光致发光提出较早，光致发光有两种常见的类型荧光和磷光，它们都是化学体系被电磁辐射所激发，然后发射出相同或较长波长的辐射。其中磷光，从分析角度看，意义不是很大。荧光由于其固有的灵敏性而受到人们的偏爱。

荧光标记方法的检出限可达10-15～10-18水平。简单和复杂的气态、液态和固态化学体系均可发荧光。最简单的荧光有稀的原子蒸气发出，经过10-8秒后电子回到基态同时发出两种相同的辐射，这称为共振荧光。有些物质受激后发射出波长较长的特征辐射，这种现象叫Strokes位移。荧光现象只限于相当少数其结构和环境特点使其无辐射弛豫或活化过程的速率减慢到发射反应可在动力学上与其相匹配程度的体系。

荧光发射又称为去活化过程，它受发射速率和振动弛豫影响。荧光发射是激发过程的逆过程，所以受激态寿命和对应于激发过程的吸收峰的摩尔吸收系数之间存在一个倒数关系，实验证明摩尔吸收系数在103～105时，荧光去活化的寿命为10-7～10-9秒。

振动弛豫即在电子激发过程中分子可被激发到任何振动能级，但在溶液中，过量的振动能量会由于受激组分的分子与溶剂分子间的碰撞而马上消失，结果能量转移只是使溶剂的温度有一个微小的改变。影响荧光的因素有量子产率、荧光跃迁类型、荧光物质的结构、溶液的温度和溶剂效应、溶液的PH值以及溶解氧的含量等。量子产率是发射荧光分子的数目与受激态分子总数之比。

荧光跃迁类型指键的跃迁，一般σ—σ跃迁产生荧光很少见，表现为荧光很少由吸收波长小于205nm的紫外辐射引起，而主要限于π—π、π—η跃迁。一般含有芳香官能团的化合物发射荧光强度最大，最简单的杂环化合物如吡啶、呋喃和吡咯等不发射荧光，稠环化合物一般发射荧光。实验发现刚性结构的分子容易发射荧光，同时有机络合剂与金属离子形成络合物使发射荧光增强。大多数荧光效率会随温度增加而增加。溶剂的极性对荧光强度也有影响，一般成正比关系。

PH对荧光有较大的影响，一般因物质而异，所以荧光为基础的分析需要严格控制PH值。溶解氧的存在可使荧光强度降低。常见的荧光素发射荧光由由以下几个过程的综合结果（见图1.1以Eu3+为例）。在外激发阶段，荧光团吸收外激发光所提供的能量，由于分子振动，使荧光团从基态（S0）跃迁到激发态。在这种状态下，大部分荧光团迅速释放能量，通过内转换（非放射衰减）转变为最低的振动水平S1，这个过程产生荧光发射谱。

2、镧系复合物荧光机理

镧系（lanthanide）元素包括15种元素，大多以氧化态存在，且性质相似，共生在同一矿物中，很难进行分离和提纯。镧系元素具有特殊的物理、化学性质，因此镧系元素和其化合物有广泛的应用价值。目前镧系元素及其化合物已成为现代尖端科学技术不可缺少的特殊材料。例如超导材料、电子材料、合金材料等。镧系元素中Sm3+、Eu3+、Tb3+和Dy3+可发荧光，可以在荧光免疫分析中使用。镧系复合物中，镧系离子的电子跃迁，主要来自三方面：f—f、4f—5d、电荷跃迁。Sm3+、Eu3+、Tb3+和Dy3+等属于f—f跃迁，所以这些离子本身所吸收的能量和发射的荧光强度是很低的，在分析中很难利用。它们通常需结合一个有机复合物（螯合物，Chelate），作为媒介使能量向离子转移。

镧系复合物（lanthanide complex）发射荧光与常规的荧光团（fluorophores）的不同之处在于：㈠配体（不是镧系离子本身）从外部吸收能量发生S0到S1转化，然后在发生内部转化。㈡从最低级的振动水平S1跃迁到三重态（T1）水平的内系统交叉，进一步促进能量在分子内部的转移，从配体的T1状态下转移到螯合物镧系离子外层4f的电子轨道，即能量从螯合物转移到了镧系离子，使镧系离子处于激发态。这个过程需要使配体（一般为螯合物）内转化减小或失活（S1 S0和T1 S0），同时要求处于T1状态下的配体能量水平与镧系离子共振水平相匹配（靠近或稍高）。㈢多重发射。在镧系复合物中，由于少数几个电子转移5D0 7FJ（J=0，1，2，3，4）和5D0 7FJ（J=1，2，3，5，6），其中最集中的转移是5D0 7F2和5D0 7F1， 出现了多重发射现象，伴随发射波长610—660nm和585—600nm。

在上述发射荧光机理中镧系复合物有三个主要优势：

（1）最大的Stokes位移，荧光物质激发光谱曲线的最大吸收波长和发射光谱的最大发射波长之间的差,称为Stokes位移。在内部转移期间，由于能量的分配，内系统的交叉，分子内部的能量转移，使从镧系复合物发出的量子与激发光有明显的不同，Stokes位移达200nm,很容易分辨激发光和发射光，从而排除激发光干扰。而普通荧光物质荧光光谱的Stokes位移只有几十纳米，激发光谱和发射光谱通常有部分重叠，互相干扰严重。镧系复合物的这种特性可避免激发光谱和荧光发射光谱以及生物基质发射的光谱重合（见图1.2）。

图1.2 Unique fluorescence properties of lanthanides, large Stokes’ shift

（2）镧系元素与普通的荧光团比较，镧系元素离子螯合物荧光的衰变时间（decay time）长（10～2000us），为传统荧光的10³～10⁶倍（见图1.3）。镧系元素的荧光不仅强度高，而且半衰期也很长，介于10～1000us之间。这样，用时间分辨荧光仪测量Eu3+螯合物的荧光时，在脉冲光源激发之后，可以适当的延迟一段时间，待血清、容器、样品管和其他成分的短半衰期荧光衰变后再测量，这时就只存Eu3+标记物的特异性荧光，即通过时间分辨，极大地降低了本底荧光,实现了高信噪比,这是TRFIA高灵敏度和低干扰的原因之一。如果在使用链霉亲合素-生物素系统,可更好地降低非特异性荧光的干扰；

图1.3 Unique fluorescence properties of lanthanides, long fluorescence decay times

(3) 镧系螯合物激发光光谱较宽，最大激发波长在300～500nm，可通过增加激发光能量来提高灵敏度。而它的发射光谱带（line-like bands）很窄，甚至不到10nm，可采用只允许发射荧光通过的滤光片，进一步降低本底荧光，镧系复合物虽然量子产量较常规的荧光团为低的主要波段的荧光强度是非常强的，原因在于能量的转移大部分是通过这个波段发射的。狭窄的发射波段为多次分析成为可能，更不必担心光谱重叠（见图1.4）

 

图1.4 The wavelength of the fluorescence light，narrow emission band