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SDS法提取植物基因组DNA

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20112

本方法由Dellaporta,Wood和Hicks(1983)的方法修改而成。其基本原理是研磨的组织细胞用热的SDS裂解后,加入高浓度的KAc,0℃放置以除去蛋白和多糖类杂质,最后用乙醇或异丙醇沉淀。

一 材料、试剂和仪器

1 材料 新鲜的组织材料或-80℃冻存的材料

2 试剂

(1)提取缓冲液

Tris-HCl 100mmol/L(pH8.0)

EDTA 50mmol/L (pH8.0)

NaCl 500 mmol/L

灭菌后加β-巯基乙醇至10 mmol/L

(2)裂解液20%SDS

(3)高盐溶液5mol/L KAc

(4) RNaseA 10mg/ml

(5) 异丙醇

(6)灭菌ddH2O或TE

3. 仪器: 离心机, 恒温水浴, 台式高速离心机,电泳装置

二 实验程序

1取幼嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净,再用灭菌ddH2O冲洗2次,放入经液氮预冷的研钵中,加入液氮研磨至粉末状,用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500μL提取液的离心管中,轻轻混匀。

2 向管中加入50μL20%SDS溶液,混匀,不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂 ,65℃保温10min,并不时摇动。

3 加入150μL 5mol/L KAc,混匀,置冰上20-30 min。

4 4℃,15 000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中,加入0.7V的异丙醇,混匀,-20℃沉淀30 min 。

5 12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀,吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。

6 加入1/10体积的RNaseA,37℃保温20min,除去RNA。

7 CI抽提后,加2V乙醇,-20℃沉淀30 min 。12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀。

8 用400μL 70%乙醇洗一次后,吹干,加入适量的灭菌ddH2 O或TE溶解DNA。

9 电泳检测完整性。


三、结果分析

1. 用紫外分光光度计在230nm、260nm、 280nm和310nm波长分别读数。其中260nm用琼脂糖凝胶电泳(0.8%)检测核DNA的完整性(见图2 )。

完整性好的基因组DNA应是一条比23Kb滞后的电泳带, 若降解则成为弥散状。

电泳前缘为未除干净的RNA。

2.如果DNA沉淀呈白色透明状而且溶解后成粘稠状,说明DNA含有较多的多糖类物质,可以在取材前将植物放暗处24hr,以达到去除淀粉的目的。

3. DNA沉淀呈棕色,难以酶切

植物材料含有大量酚类化合物,与DNA共价结合,使DNA呈棕色,并抑制DNA的酶解反应。为防止此情况出现,可在加入2 ×CTAB的同时加入2-5%的巯基乙醇,或者加入亚精胺(100μl DNA加5μl 0.1mol/L的亚精胺)。

4.DNA中含有多糖或盐类

将DNA用100%乙醇或异丙醇沉淀出来,离心,沉淀用70%乙醇清洗两次或更多次,吹干后重溶于TE中。(注意乙醇一定要吹干, 否则电泳点样时, 样品上漂)

5.DNA已降解电泳条带呈弥散状

样品降解可能有两种情况:一是机械振动过剧烈,二是操作过程中DNase污染。在提取DNA的各个操作过程中要避免剧烈振荡,提取液及用品要高温高压灭菌。另外,使用Tip头吸取过程中应避免产生气泡,Tip头应剪去Tip头尖,避免反复冻融DNA。

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