植物组织中蔗糖酶活力的测定
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一、目的
了解植物组织中提取蔗糖酶的方法,掌握蔗糖酶活力测定的原理。
二、原理
本实验以Nelson 方法测定酶活力,其原理是:蔗糖酶可将非还原性的蔗糖水解为葡萄糖和果糖,而葡萄糖作为还原糖含有的自由醛基,在碱性溶液中将Cu 2+ 还原,还原糖本身被氧化成羟酸;砷钼酸试剂与氧化亚铜生成蓝色复合物(砷钼蓝),在510nm 波长下有正比于还原糖浓度的光密度,从而确定蔗糖酶的活力,该法测定的范围为25~200μg。
三、操作步骤
1.标准曲线制作
(1)取9 个具塞试管,按表1 加样:
(2)向每管中加1mL Nelson 试剂,盖上塞子,置沸水浴中20 min。冷至室温,向每管中加1 mL 砷钼酸试剂。
(3)5 min 后,向每管中加7mL 蒸馏水,混匀。
(4)在510 nm 下测定光密度,以还原糖葡萄糖为横坐标,以OD510nm 值为纵坐标,制作标准曲线。
2.酶活力测定
取2g 小麦苗,加入2mL 乙酸缓冲液,在冰浴中用研钵研磨成糊状,12 000r/min 离心10min,留取上清液用于酶活测定。取2 支具塞刻度试管,向每个试管中加入乙酸缓冲液0.8ml,0.5 mmol/L 蔗糖溶液0.2mL,适当稀释的酶液1mL,以同样处理但不加酶液者为空白对照,室温下放置10min。然后向每管中加1mL Nelson 试剂,置沸水浴中20min。冷却至室温,向每管中加1mL 砷钼酸试剂,5min 后,向每管中加7mL 蒸馏水,510 nm 下比色,测定光密度OD510nm。
四、 实验结果
活力计算:在室温、pH4.5 条件下,每分钟水解产生1μmol 葡萄糖所需的酶量,定义为酶的1 个活力单位(U)