植物组织中脂肪氧化酶活力的测定

相关专题

 

脂肪氧化酶（LOX）是一种含非血红素铁的蛋白质，专一催化具有顺、顺-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸加氧反应，氧化生成具有共轭双键的过氧化氢物。它广泛存在于高等植物 体内，与植物的生长发育、植物的衰老、脂质过氧化作用和光合作用、伤反应及其他胁迫反应等有关。

【原理】
根据基质浓度一定、反应体系中溶解氧浓度的变化与酶活力大小呈线性相关的原理进行测定。LOX氧化多元不饱和脂肪酸形成具有共轭双键的过氧化氢物时消耗氧气，溶液中氧浓度的减少速率与酶活力大小成正比，利用氧电极可以精确地测定酶活力。

【仪器与用具】
氧电极1套；记录仪1台；超级恒温水浴锅1台；离心机1台；抽滤器 1套；1ml注射器1支；吸量管：5ml 1支，1ml 1支；吸耳球1个；小研钵1套；剪刀1把。

【试剂】
0.25%亚油酸；Tris-盐酸缓冲液（25mmol/L，pH7.5）；石英砂；0.5mol/L氯化钾溶液；

【方法】
1.样品提取 取新鲜植物样品，擦净组织表面污物，剪碎混匀，称取0.5g放入研钵中，加入5ml 25mmol/L Tris-盐酸缓冲液（pH7.5），于冰浴中研磨，研成均浆，利用高速冷冻离心机 于0~4℃条件下离心（4000×g）5min，上清液为粗酶提取液。
2.测定 氧电极的操作方法见仪器的操作手册。开启恒温水浴，调节测定温度为25℃。
洗净氧电极反应杯，先加入2.5mlTris-盐酸缓冲液、1ml酶提取液，放松磁力搅拌制动器，保温平衡5~10min，制动磁块，把电极插入反应杯中，从狭槽中排出全部空气，用1ml注射器加长针头从狭槽中注入0.25%亚油酸0.2ml，打开记录仪记录耗氧曲线（走纸速度的大小视酶活力确定，曲线呈45度角为宜），测定5min，吸取废液，清洗反应杯进行下一个样品的测定。
3.计算结果
本实验以空气饱和水中的含氧量为标准对电极进行标定，求算出测定温度下，记录纸每个小格所代表氧量的变化值。
从样品测定曲线上选定耗氧的下降格数（n），根据走纸速度（v）和下降n格走纸的距离（L），可求出测定液中耗氧的变化速率（R）：
R（μmol O2/min）＝n×μmol O2/格×v/L
根据提取液体积和样品重量，即可求出LOX的活力：
LOX(μmol·g﹣1·min﹣1)=R×V/W
式中 V－提取液的体积；
W－样品鲜重。