植物组织中蔗糖酶活力的测定

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一、目的

了解植物 组织中提取蔗糖酶的方法，掌握蔗糖酶活力测定的原理。

二、原理

本实验以Nelson 方法测定酶活力，其原理是：蔗糖酶可将非还原性的蔗糖水解为葡萄糖和果糖，而葡萄糖作为还原糖含有的自由醛基，在碱性溶液中将Cu 2+ 还原，还原糖本身被氧化成羟酸；砷钼酸试剂与氧化亚铜生成蓝色复合物（砷钼蓝），在510nm 波长下有正比于还原糖浓度的光密度，从而确定蔗糖酶的活力，该法测定的范围为25~200μg。

三、主要仪器及试剂

1．仪器

（1）分光光度计
（2）刻度具塞试管（20 mL）
（3）恒温水浴

（4）移液管

2．试剂

（1）4mmol/L 葡萄糖20mL
（2）4mmol/L 蔗糖20mL
（3）0.5 mmol/L 蔗糖200mL
（4）0.2 mol/L 乙酸缓冲液pH 4.5，200mL

（5）Nelson 试剂：

A 试剂：100mL 溶剂中含 Na2CO3 2.5g，NaHCO3 2.0g，Na2SO4 20g，酒石酸钾钠 20g。

B 试剂：100 mL 溶剂中CuSO4·5H2O 15g，浓H2SO4 2 滴。

以A:B=50: 2 的比例混合即可使用，使用前需在37℃以上溶解，防止溶质析出。

砷钼酸试剂：100 mL 中含钼酸铵5 g，浓H2SO4 4.2 mL，砷酸钠0.6g。

四、操作步骤

1．标准曲线制作
（1）取9 个具塞试管，按表1 加样：

（2）向每管中加1mL Nelson 试剂，盖上塞子，置沸水浴中20 min。冷至室温，向每管中加1 mL 砷钼酸试剂。

（3）5 min 后，向每管中加7mL 蒸馏水，混匀。

（4）在510 nm 下测定光密度，以还原糖葡萄糖为横坐标，以OD510nm 值为纵坐标，制作标准曲线。

2．酶活力测定

取2g 小麦苗，加入2mL 乙酸缓冲液，在冰浴中用研钵研磨成糊状，12 000r/min 离心10min，留取上清液用于酶活测定。取2 支具塞刻度试管，向每个试管中加入乙酸缓冲液0.8ml，0.5 mmol/L 蔗糖溶液0.2mL，适当稀释的酶液1mL，以同样处理但不加酶液者为空白对照，室温下放置10min。

然后向每管中加1mL Nelson 试剂，置沸水浴中20min。冷却至室温，向每管中加1mL 砷钼酸试剂，5min 后，向每管中加7mL 蒸馏水，510 nm 下比色，测定光密度OD510nm。

五、 实验结果

活力计算：在室温、pH4.5 条件下，每分钟水解产生1μmol 葡萄糖所需的酶量，定义
为酶的1 个活力单位（U）

n：稀释倍数；

V：酶液的总体积（mL）；

W：样品重(g)；

t：时间（10min）；

1000：毫摩尔转化为微摩尔的倍数。