单克隆抗体制备常见问题分析

1. 免疫失败的可能原因及应采取的措施

答：有时不能获得满意的抗血清，可从下列几方面找原因，并改进之。

（1）免疫动物的种属及品系是否合适，可考虑改变动物的种属或品系，或扩大免疫动物的数量。

（2）抗原质量是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法。

（3）制备的免疫原是否符合要求，可从偶联剂，载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑，并加以改进。

（4）所用的佐剂是否合适，乳化是否完全，可改用其它佐剂，或加强乳化。

（5）免疫的方法、剂量，加强免疫的间隔时间和次数，免疫的途径是否合适。

（6）动物的饲养是否得当，如营养（饲料、饮水）、环境卫生（通风、采光、温度）是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。

2. 制备单克隆抗体影响因素、失败原因分析

答：由于制备McAb的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。其主要失败原因和影响因素有：

（1）污染

包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。

在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。

（2）融合后杂交瘤不生长，在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素

PEG有毒性或作用时间过长。

牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。

骨髓瘤细胞污染了支原体。

HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。

（3）杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体

融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。

有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。Goding91982）曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。

三要：

要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。

要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。

要定期进行再克隆。

三不要：

不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。

不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。

不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。

（4）杂交瘤细胞难以克隆化

可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT